姜黃素聯(lián)合負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的乙醇質(zhì)體治療抗銀屑病的臨床研究

蔡美紅，劉向東

（武漢市武昌醫(yī)院，湖北武漢430063）

銀屑病是一種較常見的慢性免疫性炎癥性皮膚病[1]，其病因與免疫、遺傳、代謝和環(huán)境等多重因素有關(guān)。目前在臨床上治療主要以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)角質(zhì)化正常和止癢為主[2]。姜黃素是一種天然的酚羥基化合物，類屬于植物多酚，可有效抑制腫瘤壞死因子（TNF）-α的表達(dá)，有抗氧化、抗炎、抗微生物和抗癌作用[3]。TNF-α是銀屑病中促進(jìn)炎性反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子。銀屑病與抑制核因子（NF）-κB和激活蛋白等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有關(guān)，但其水溶性和穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其生物利用度低[4]。透明質(zhì)酸是一種天然高分子多糖，透明質(zhì)酸分子有強(qiáng)烈的親水性，可被透明質(zhì)酸酶快速降解，用其修飾藥物分子可顯著改善其水溶性[5]。經(jīng)透明質(zhì)酸修飾的姜黃素有良好的水溶性[6]，從而提高了姜黃素的生物利用率。目前銀屑病的主要診斷依據(jù)是實(shí)驗(yàn)室檢測，主要以免疫指標(biāo)、分子生物學(xué)指標(biāo)和銀屑病皮損組織為主[7]，免疫學(xué)檢測主要以免疫球蛋白：IgG和IgA為主，分子生物檢測主要以血清中的白細(xì)胞介素（IL）-2和IL-4為主[8]。對于銀屑病病情程度的評價(jià)目前主要依據(jù)銀屑病皮損面積和嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評分標(biāo)準(zhǔn)[9]。本研究通過分析受試者—銀屑病患者使用姜黃素聯(lián)合負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的質(zhì)體后的臨床表現(xiàn)，旨在為銀屑病的治療找到較好途徑并提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩選2017年10月—2018年12月門診就診的90例銀屑病患者。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡30～50歲；②性別不限；③全部受試者經(jīng)診斷均為尋常型銀屑??；④患者在3個(gè)月之內(nèi)均未接受過相關(guān)系統(tǒng)治療，對于治療前、后皮損組織活檢，均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①血液系統(tǒng)疾病患者；②自身免疫性疾病患者；③惡性腫瘤患者；④嚴(yán)重的心、肝、腎、肺疾病患者；⑤妊娠及哺乳期婦女。受試者及家屬簽署同意參與研究的同意書；本研究已經(jīng)獲得武漢市武昌醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號2017-0258）。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 根據(jù)患者頭部、上肢、軀干和下肢所占面積的百分比之和，進(jìn)行PASI評分。根據(jù)90例患者的PASI評分，將其按照評分大小，分為3組進(jìn)行治療：30分為A組；皮損25～30分為B組；皮損20～25分為C組，治療療程為2個(gè)月。

3組的治療方法一樣。①姜黃素治療銀屑病30例患者，試驗(yàn)每日給予姜黃50g，煎水200 mL分2次口服，療程為2個(gè)月。服藥期間避免感染、勞累、精神緊張及辛辣刺激食物等誘發(fā)因素。避免內(nèi)服和外用其他治療銀屑病的藥物。②負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的乙醇質(zhì)體（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院四環(huán)制藥廠）皮下注射療法：透明質(zhì)酸修飾的包封美白成分的脂質(zhì)體，按質(zhì)量百分比由以下組分組成：美白成分10%～30%，磷脂15%～50%，膽固醇1%～15%，脂質(zhì)體表面正電荷控制劑1%～10%，吐溫-80 5%～15%，脂溶性抗氧化劑 0.5%～5%，透明質(zhì)酸 0.1%～2%，1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺0.05%～1%，凍干保護(hù)劑10%～60%，水1%～5%，以上共同組成負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的乙醇質(zhì)體，皮下注射1 mL/次，1次/d，療程為2個(gè)月。

1.2.2 銀屑病皮損嚴(yán)重程度評判標(biāo)準(zhǔn) 本研究中治療情況評判標(biāo)準(zhǔn)以PASI評分法評價(jià)銀屑病皮損嚴(yán)重程度。

1.2.3 銀屑病皮損組織NF-κB mRNA的測定 用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測定治療前后銀屑病皮組織中NF-κB mRNA的表達(dá)情況。引物設(shè)計(jì)使用DNAStar軟件完成，并由上海生工生物技術(shù)公司完成合成?？俁NA的提取按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行。PCR采用 25 μL反應(yīng)體系：2.5 mmol/L dNTP，10 mmol/L DDT，2 mmol/L MgC12，10 mmol/L Tris-HCl，2U Taq 酶，1 μL cDNA，50 mmo/L KCl，焦碳酸二乙酯（DEPC）水補(bǔ)足25 μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)。按照 95℃、7 min。一個(gè)循環(huán)；94℃、30 s，72℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃、7 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中穩(wěn)壓電泳。利用凝膠成像儀觀察、分析并拍照。

1.2.4 血液樣本的采集 采血前1天囑咐患者禁食，并于隔天上午9時(shí)左右進(jìn)行采血，血樣選為靜脈血，使用一次性真空采血管，采血量為5 mL。采血后靜置20 min，使血液完全凝固后，使用離心機(jī)3 500轉(zhuǎn)/min離心15 min，取上清2 mL于EP管中，放置-80℃冰箱保存。應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.2.5 血清中IgA和IgG檢測 采用免疫比濁法測定血清中IgA和IgG的變化[10]，該方法原理為：特異性抗原與免疫球蛋白在特定的系統(tǒng)中可形成有一定結(jié)構(gòu)的可溶性免疫復(fù)合物，并懸浮于反應(yīng)溶液中，根據(jù)其特殊的光學(xué)性質(zhì)，選用分光光度計(jì)檢測該復(fù)合物的吸光度，通過計(jì)算可知該復(fù)合物的濃度，進(jìn)而得到免疫球蛋白的濃度，檢測波長為340 nm。

1.2.6 血清中IL-2和IL-4的測定 血清中細(xì)胞因子IL-2和IL-4的測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，該方法的操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行：①設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，分別對應(yīng)添加100 μL于酶標(biāo)板底部，加板37℃孵育2 h；②丟棄液體并甩干，每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μL，加板37℃孵育1 h；③使用緩沖液反復(fù)清洗3次，每次浸泡2 min，并甩干；④每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記工作液100 μL，37℃孵育1 h；⑤使用緩沖液反復(fù)清洗3次，每次浸泡2 min，并甩干；⑥加入顯色劑TMB，37℃避光孵育30 min；⑦依序向反應(yīng)孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定每孔的光密度（OD值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國IBM公司）進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況及臨床療效評價(jià) 在本研究中有90例銀屑病患者，其中女36例，男54例，在治療前及治療后對患者進(jìn)行PASI評價(jià)，根據(jù)其嚴(yán)重程度將90例患者分為3組進(jìn)行研究，PASI評分在30以上有23例，為A組；25～30之間有35例，為B組；20～25之間有32例，為C組。占比分別為25.6%，38.9%，35.6%。對治療后的患者進(jìn)行PASI評價(jià)，23例的 PASI評分為（19.1±3.4），35例的 PASI評分為（15.3±2.8），32 例 PASI評分為（12.7±2.6）。治療后與治療前相比，3組治療情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 患者臨床療效評價(jià) （分，±s）

表1 患者臨床療效評價(jià) （分，±s）

組別 n 治療前 治療后A 組 23 31.6±1.6 19.1±3.4 B 組 35 27.4±2.1 15.3±2.8 C 組 32 23.2±1.6 12.7±2.6 F 10.475 9.326 P 0.024 0.019

2.2 銀屑病皮損組織NF-κB mRNA的測定 3組治療情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明該藥物對皮損組織NF-κB mRNA的表達(dá)有一定的抑制作用。見表2。

2.3 血清中IgA和IgG的測定 與正常對照組相比，A組銀屑病患者的免疫球蛋白IgA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B組和C組患者的免疫球蛋白IgA，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組相比，3組患者的免疫球蛋白IgG的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、4。

表2 皮損組織NF-κB mRNA的測定 （±s）

表2 皮損組織NF-κB mRNA的測定 （±s）

組別 n 治療前 治療后A 組 23 0.916±0.115 0.618±0.107 B 組 35 0.775±0.117 0.484±0.087 C 組 32 0.647±0.094 0.373±0.059 F 13.427 16.713 P 0.016 0.021

表3 免疫球蛋白IgA的表達(dá)水平變化 （g/L，±s）

表3 免疫球蛋白IgA的表達(dá)水平變化 （g/L，±s）

組別 n 治療前 治療后A 組 23 3.36±0.86 2.74±0.76 B 組 35 2.52±1.03 2.47±0.94 C 組 32 2.49±0.64 2.38±0.88 F 14.625 10.123 P 0.025 0.019

表4 免疫球蛋白IgG的表達(dá)水平變化 （g/L，±s）

表4 免疫球蛋白IgG的表達(dá)水平變化 （g/L，±s）

組別 n 治療前 治療后A 組 23 14.23±1.81 13.08±1.43 B 組 35 13.47±1.25 12.29±1.17 C 組 32 12.68±1.31 11.54±0.97 F 11.854 15.633 P 0.026 0.017

2.4 血清中IL-2和IL-4的測定 與正常對照組相比，3組接受治療的銀屑病患者血清中IL-2和IL-4表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且治療后IL-2和IL-4的表達(dá)高于正常對照組。見表5、6。

表5 血清中IL-2的表達(dá)變化 （pg/mL，±s）

表5 血清中IL-2的表達(dá)變化 （pg/mL，±s）

組別 n 治療前 治療后A 組 23 1.63±1.72 1.35±1.34 B 組 35 1.57±1.64 1.12±1.21 C 組 32 1.47±1.83 0.86±0.79 F 16.528 14.863 P 0.026 0.035

表6 血清中IL-4的表達(dá)變化 （pg/mL，±s）

表6 血清中IL-4的表達(dá)變化 （pg/mL，±s）

組別 n 治療前 治療后A 組 23 0.95±1.17 0.69±1.14 B 組 35 0.88±1.26 0.58±0.94 C 組 32 0.73±0.84 0.48±1.15 F 13.472 12.285 P 0.014 0.031

3 討論

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的皮膚病，其特征是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增生和分化不良，并伴有皮膚血管化、成纖維細(xì)胞的激活和白細(xì)胞浸潤[11]，如IL-2，IL-4等的激活所介導(dǎo)的[12]。姜黃素可調(diào)節(jié)多種分子靶點(diǎn)和作用機(jī)制[13]，例如抑制或下調(diào)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[14]，從而有效治療銀屑病。但姜黃素水溶性和穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其藥效降低。姜黃素經(jīng)透明質(zhì)酸修飾后不僅可以增加其溶解性還可以增加其生物利用率[15]，可進(jìn)一步提高姜黃素治療銀屑病的療效。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞中多種基因的表達(dá)和調(diào)控[16]，是細(xì)胞激活的信號標(biāo)志。姜黃素可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞中的NF-κB的表達(dá)。有研究指出[17]，姜黃素可能通過抑制NF-κB激酶（IKK）的活性，減低NF-κB的表達(dá)，從而抑制角質(zhì)的細(xì)胞增殖。在本試驗(yàn)中，患者通過經(jīng)透明質(zhì)酸修飾的姜黃素的治療后，3組不同患病程度的PASI的評分均得到改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過測定90例患者的治療前后皮損組織中NF-κB mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在使用姜黃素治療后，3組患者皮損組織中NF-κB mRNA表達(dá)下降，證實(shí)姜黃素可以調(diào)節(jié)皮損組織中NF-κB mRNA的表達(dá)，從而達(dá)到治療效果。

免疫球蛋白是一類有抗體活性的蛋白質(zhì)，當(dāng)免疫功能和組織代謝出現(xiàn)問題時(shí)，會免疫蛋白含量會發(fā)生變化，出現(xiàn)某一種免疫球蛋白突然增加或降低[18]。本試驗(yàn)通過檢測90例銀屑病患者治療前后和50例正常對照血清中IgA和IgG，得出銀屑病患者血清中IgA和IgG比正常人血清中IgA和IgG高，通過姜黃素聯(lián)合負(fù)載透明質(zhì)酸的乙醇質(zhì)體的治療后，90例患者血清中IgA和IgG均有所下調(diào)，與治療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明銀屑病有免疫系統(tǒng)紊亂問題。而該藥物可降低銀屑病患者免疫球蛋白的表達(dá)。銀屑病患者的組織病理表現(xiàn)為角質(zhì)細(xì)胞的異常分化增殖和單核細(xì)胞的浸潤[10]。單核細(xì)胞屬于T淋巴細(xì)胞因子，可釋放多種炎性介質(zhì)，而其中的某些細(xì)胞因子可有助于T細(xì)胞的增強(qiáng)和活化[18]。T細(xì)胞被活化后，通過刺激角蛋白的產(chǎn)生及表達(dá)，因而進(jìn)一步導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和角化不良，從而導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的惡性循環(huán)[19]。炎性介質(zhì)的異常導(dǎo)致IL等細(xì)胞因子也出現(xiàn)異常增高[20]。在本試驗(yàn)中，通過檢測患者血清中IL-2和IL-4，檢測結(jié)果表明銀屑病患者的細(xì)胞因子IL-2和IL-4高于健康對照組的水平，說明銀屑病與T淋巴細(xì)胞有關(guān)，而T淋巴細(xì)胞作為機(jī)體的免疫細(xì)胞，T細(xì)胞在表皮中過度增值分化時(shí)，會產(chǎn)生大量的增殖性細(xì)胞因子[21]，大量的增值性細(xì)胞因子的刺激導(dǎo)致表皮細(xì)胞的過度增殖分化，從而形成了銀屑病中的皮損組織[22]。通過治療后，血清中的IL-2和IL-4下降，姜黃素聯(lián)合負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的乙醇質(zhì)體可透過各種屏障，達(dá)到抑制細(xì)胞因子的增殖分化作用，并且姜黃素聯(lián)合負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的乙醇質(zhì)體可降低T細(xì)胞的活化程度，使其相關(guān)蛋白表達(dá)降低，從而緩解銀屑病病情。

綜上所述，姜黃素聯(lián)合負(fù)載透明質(zhì)酸修飾的乙醇質(zhì)體通過下調(diào)銀屑病患者皮損組織中NF-κB mRNA的表達(dá)、降低患者血清中的免疫球蛋白的含量以及細(xì)胞因子——IL-2和IL-4的表達(dá)，可有效緩解銀屑病患者的病情。