菠蘿蜜低聚肽對(duì)γ射線輻照小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

郝云濤 劉睿 珠娜 劉欣然 胡佳妮 康家偉 毛瑞雪 張亭 李勇

摘?要：目的：探究菠蘿蜜低聚肽（JOPs）對(duì)γ射線輻照導(dǎo)致小鼠氧化損傷的保護(hù)作用。方法：選取96只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、乳清蛋白組（0.40 g/kg·BW）及3個(gè)JOPs干預(yù)組（0.20、0.40、0.80 g/kg·BW），每組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，8只/亞組。行灌胃干預(yù)第14 d除空白組外，小鼠接受60Co γ射線全身輻照，劑量3.5 Gy，劑量率1 Gy/min。兩亞組分別在輻射后第3 d和第14 d檢測(cè)小鼠血清和肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）水平。結(jié)果：輻照后第3 d及第14 d，相比空白組，模型組血清、肝臟SOD及GSH-Px活性均顯著降低，MDA水平均顯著增高，JOPs各劑量組小鼠血清及肝臟MDA水平均顯著低于模型組與乳清蛋白組;輻照后第3 d，相比模型組，JOPs各劑量組小鼠血清及肝臟SOD、GSH-Px活性均顯著增高，且高劑量組小鼠血清SOD活性及血清、肝臟GSH-Px活性與中、高劑量組肝臟SOD活性均顯著高于乳清蛋白組;輻照后第14 d，相比模型組，JOPs各劑量組小鼠血清及肝臟SOD、GSH-Px活性均顯著增高，且JOPs各劑量組小鼠血清SOD活性與高劑量組肝臟SOD、GSH-Px活性均顯著高于乳清蛋白組。結(jié)論： JOPs對(duì)γ射線輻照所致氧化損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：菠蘿蜜低聚肽;γ射線;氧化損傷;超氧化物歧化酶;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶;丙二醛

自由基學(xué)說(shuō)是電離輻射所致氧化損傷的理論基礎(chǔ)，當(dāng)機(jī)體受到射線輻照，機(jī)體中的水發(fā)生電離分解產(chǎn)生多種自由基，攻擊機(jī)體細(xì)胞組織從而造成損傷[1-3]。然而，目前輻射防護(hù)劑多為化學(xué)合成物質(zhì)，臨床效果有限且毒副作用大，尋找安全有效、毒副作用小的天然抗輻射劑是亟待解決的問(wèn)題[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人參低聚肽、核桃低聚肽等均可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力，降低電離輻射引起的氧化損傷[5-6]。1 000余年前，菠蘿蜜被引入我國(guó)，現(xiàn)廣泛種植于我國(guó)南方多省，年產(chǎn)量及總產(chǎn)值可觀[7-9]。菠蘿蜜是藥食兩用食物，其保健作用早在《本草綱目》有過(guò)記載[10-14]。菠蘿蜜果肉及種子中蛋白質(zhì)含量豐富，遠(yuǎn)超其他常見水果[15-17]。菠蘿蜜低聚肽（JOPs）是利用生物酶解技術(shù)從菠蘿蜜果肉和種子中制取得到的小分子生物活性肽，主要成分是小分子活性寡肽。目前尚無(wú)關(guān)于JOPs通過(guò)抗氧化功能發(fā)揮其輻射防護(hù)作用的研究報(bào)道，本研究采用γ射線輻照BALB/c小鼠，通過(guò)檢測(cè)輻照后小鼠血清和肝臟SOD活性、GSH-Px活性及MDA水平，探究JOPs對(duì)電離輻射所致氧化損傷的保護(hù)作用。

1?材料與方法

1.1?樣品

JOPs，淡黃色固體粉末，主要成分為分子量<1 000 Da的寡肽，購(gòu)自海南盛美諾生物技術(shù)有限公司。

1.2?主要試劑與儀器

HFY-1A沽源控制臺(tái)、HFY-601固定式多路X、γ劑量率儀、60Co γ射線輻射源，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院;小鼠SOD、GSH-Px和MDA檢測(cè)試劑盒，北京麥格泰克科技有限公司。

1.3?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

96只健康SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0041。分籠飼養(yǎng)，4只/籠，自由飲食、飲水，飼喂SPF級(jí)小鼠生長(zhǎng)飼料。動(dòng)物房屏障環(huán)境飼養(yǎng)小鼠，溫度24～26℃，相對(duì)濕度50%～60%，室內(nèi)照明光暗周期節(jié)律12h/12h，照明時(shí)間7∶00～19∶00。

1.4?實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理?適應(yīng)1周后，按體重將96只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、乳清蛋白組（0.40 g/kg·BW）及JOPs低、中、高劑量干預(yù)組（0.2、0.4、0.8 g/kg·BW），16只/組，再將每組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，8只/亞組。兩亞組小鼠均接受3.5Gy輻照劑量，制造輻射損傷動(dòng)物模型。

1.4.2?血清抗氧化指標(biāo)檢測(cè)?灌胃干預(yù)第14 d，除空白組外，其他各組小鼠均一次性接受3.5 Gy的60Co γ 射線全身輻照，吸收劑量率為1 Gy/min，輻照后繼續(xù)灌胃干預(yù)，分別在輻射后第3 d和第14 d摘眼球取血，將血液3 000 r/min離心10 min，移取血清并按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清SOD、GSH-Px活性和MDA水平。

1.4.3?肝臟抗氧化指標(biāo)檢測(cè)?灌胃干預(yù)第14 d，除空白組外，其他各組小鼠均一次性接受3.5 Gy的 60Co γ 射線全身輻照，吸收劑量率為1 Gy/min。輻照后繼續(xù)灌胃干預(yù)，分別在輻射后第3 d和第14 d摘眼球取血后，頸椎脫臼法處死小鼠，剝離肝臟，去除表面脂肪組織和膽囊，在相同部位稱取適量肝組織，剪碎后加入冷生理鹽水，勻漿機(jī)制成10%肝組織勻漿，然后3 000r/min，離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝組織SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

1.5?統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。行One-Way ANOVA，方差齊者，組間統(tǒng)計(jì)采用LSD法;如方差不齊，組間統(tǒng)計(jì)采用Dunnetts T3法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果與分析

2.1?JOPs對(duì)輻照后第3 d小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

如表1所示，輻照后第3 d，相比空白組，模型組與乳清蛋白組小鼠血清SOD、GSH-Px活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;JOPs各劑量干預(yù)組小鼠血清SOD、GSH-Px活性均高于模型組（P<0.05），其中JOPs高劑量組小鼠血清SOD、GSH-Px活性均顯著高于乳清蛋白組（P<0.05）;模型組、乳清蛋白組及JOPs中劑量組小鼠血清MDA水平明顯低于空白組（P<0.05），此外，JOPs各劑量干預(yù)組小鼠血清MDA水平均比模型組及乳清蛋白組低（P<0.05）。

2.2?JOPs對(duì)輻照后第14 d小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

如表2所示，輻照后第14 d，模型組小鼠血清SOD、GSH-Px活性與乳清蛋白組血清SOD活性明顯低于空白組（P<0.05），而血清MDA水平明顯高于空白組;JOPs各劑量干預(yù)組小鼠血清SOD活性均比模型組及乳清蛋白組高（P<0.05）;JOPs各劑量組小鼠血清GSH-Px活性也均明顯高于模型組（P<0.05），且JOPs高劑量干預(yù)組小鼠血清GSH-Px活性明顯高于乳清蛋白組（P<0.05）;JOPs各劑量干預(yù)組小鼠血清MDA水平均低于模型組及乳清蛋白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3?JOPs對(duì)輻照后第3 d 小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表3所示，輻照后第3 d，模型組與乳清蛋白組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性明顯低于空白組（P<0.05）;相比模型組，JOPs各劑量干預(yù)組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性均明顯增高（P<0.05），并且JOPs中、高劑量組小鼠肝臟SOD活性及JOPs高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活性均較乳清蛋白組顯著增高（P<0.05）;對(duì)比空白組，模型組及乳清蛋白組小鼠肝臟MDA水平明顯降低（P<0.05），此外，JOPs各劑量干預(yù)組小鼠肝臟MDA水平均低于模型組與乳清蛋白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4?JOPs對(duì)輻照后第14d小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表4所示，輻照后第14 d，相比空白組，模型組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性與乳清蛋白組小鼠肝臟SOD活性明顯降低（P<0.05），而模型組與乳清蛋白組肝臟MDA水平明顯比空白組高（P<0.05）;相比模型組及乳清蛋白組，JOPs各劑量干預(yù)組小鼠肝臟SOD活性均明顯增高（P<0.05）;JOPs各劑量干預(yù)組小鼠肝臟GSH-Px活性均明顯比模型組高（P<0.05），且JOPs高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活性高于乳清蛋白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;相比模型組與乳清蛋白組，JOPs各劑量干預(yù)組小鼠肝臟MDA水平均明顯降低（P<0.05）。

3?討論

氧化損傷主要由于機(jī)體內(nèi)外因素導(dǎo)致的活性氧（ROS）水平急劇增加，超出了相應(yīng)的抗氧化防御體系的能力范圍引起[18]。ROS是一類高度活躍的分子，在一定劑量范圍內(nèi)，正常機(jī)體代謝不斷產(chǎn)生的ROS具有重要生理功能的信號(hào)調(diào)節(jié)作用，但如果機(jī)體在各種內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，產(chǎn)生過(guò)量的ROS，超出抗氧化體系承受的范圍，則會(huì)產(chǎn)生氧化損傷，致使各種臨床疾病的發(fā)生和發(fā)展[19-21]。電離輻射是臨床檢查、腫瘤的放射治療以及各種介入治療的重要手段，也是環(huán)境中誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，進(jìn)而引起氧化損傷的多種常見有害理化因素之一[4，22]。研究表明，電離射線與組織相互作用產(chǎn)生的大量ROS對(duì)機(jī)體生物大分子的損害，是造成機(jī)體輻照損傷的主要原因[23]。電離輻射能夠通過(guò)其高能粒子誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，引起多種組織器官氧化損傷，有效防治這種氧化損傷對(duì)于防護(hù)各種情況的輻射損傷，減輕輻射引起的臨床不良反應(yīng)，維護(hù)健康具有重要意義[24-29]。已有研究表明，通過(guò)減輕機(jī)體氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化能力，可減輕輻射損傷[30-31]。

機(jī)體具有應(yīng)對(duì)氧化損傷的抗氧化防御體系，主要由多種抗氧化酶和一些非酶類的抗氧化劑組成，正常生理狀態(tài)下這些抗氧化劑可協(xié)同作用，將ROS水平控制在適宜范圍內(nèi)[32]。SOD是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，在需氧生物中普遍存在[33]。GSH-Px可清除脂質(zhì)氫過(guò)氧化物，并在CAT含量很少或H2O2產(chǎn)量很低的組織中，可代替CAT清除在SOD催化下由O-2·轉(zhuǎn)化生成的H2O[34-35]2。作為膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，MDA具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可造成細(xì)胞代謝異常和功能破壞，因此，機(jī)體MDA的水平可反映γ射線輻照所致的氧化損傷程度[36]。

本研究結(jié)果顯示，γ射線輻照可導(dǎo)致模型組小鼠血清及肝臟SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平增高，與Dilek Kutanis等[37]的研究一致。輻照后第3 d及第14 d相對(duì)于模型組，JOPs各劑量干預(yù)組小鼠的SOD、GSH-Px活性及MDA水平均得到明顯改善（P<0.05）。輻照后第3 d，JOPs高劑量組小鼠血清SOD活性及血清、肝臟GSH-Px活性與中、高劑量組肝臟SOD活性均顯著高于乳清蛋白組（P<0.05）;輻照后第14 d，JOPs各劑量組小鼠血清SOD活性與高劑量組肝臟SOD、GSH-Px活性均顯著高于乳清蛋白組（P<0.05）。JOPs作用優(yōu)于乳清蛋白，表明JOPs對(duì)輻照所致氧化損傷的保護(hù)功效并非單純由于機(jī)體蛋白質(zhì)攝入量增加所引起。因此可推斷，JOPs可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體血清及肝臟SOD、GSH-Px活性，提高自由基清除速率，從而降低機(jī)體脂質(zhì)氧化水平，減輕細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能受損，進(jìn)而減輕機(jī)體因γ射線輻照所致的氧化損傷，發(fā)揮電離輻射防護(hù)功能。但是，JOPs的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

4?結(jié)論

本研究首次證實(shí)JOPs對(duì)機(jī)體γ射線輻照所致氧化損傷具有一定保護(hù)作用，為其作為具有輻射防護(hù)作用的新型保健食品的開發(fā)及應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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