張東明

摘要：惡性腫瘤造成大量生命危害甚至死亡，主要的治療方法有：手術(shù)切除、化學(xué)療法、放射療法、基因療法等，其中的化學(xué)療法被廣泛使用。但由于化學(xué)療法使用的藥物多屬于細(xì)胞毒性藥物，在治療的同時嚴(yán)重地破壞組織的結(jié)構(gòu)和功能，多不能連續(xù)長時間和大劑量使用，在臨床上有明顯的不良反應(yīng)，嚴(yán)重地限制了化療藥物的使用，尋找強(qiáng)效低毒的化療藥物是醫(yī)療不斷探索的課題。

含多柔比星結(jié)構(gòu)新化合物STL（簡稱STL）是在多柔比星DOX的分子上加上一個敏感的靶向集團(tuán)，構(gòu)成了一個全新藥物，其對正常細(xì)胞識別不強(qiáng)，可連續(xù)多次給藥。本實驗采用MTT法通過STL同多柔比星（DOX）在對體外細(xì)胞的抑制作用比較，結(jié)果表明對前列腺癌PC3效果良好。

關(guān)鍵詞：含多柔比星結(jié)構(gòu)新化合物STL，腫瘤，前列腺癌PC3

1.實驗材料

1.1主要試劑：STL 天津斯?jié)?，DOX北京華奉聯(lián)博公司，EDTA美國Gibco 公司，胰酶上海生物工程有限公司，PBS上海生物工程有限公司，二甲基亞砜（DMSO）上海生物工程有限公司。

常規(guī)試劑：75%乙醇，無水乙醇，氯化鈉（NaCI），氫氧化鈉（NaOH），氯化鉀（KCI），磷酸二氫鉀（KH2PO4），磷酸氫二鈉（Na2HPO4），生理鹽水，多聚甲醛等國產(chǎn)分析純。

1.2 藥物配制

STL的分子量為787，設(shè)置濃度為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，稱取STL7.87mg，溶于10mL生理鹽水中，配制成1000μmol/L的濃度，過濾后儲存。

DOX的分子量為585，設(shè)置濃度為8μmol/L，稱取DOX 5.85mg，溶于10mL生理鹽水中，配制成1000μmol/L的濃度過濾后儲存。

1.3試劑配制

1） PBS液配制：精確稱取氯化鈉（NaCl）8.0g，氯化鉀（KCl）0.2g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.44g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）0.24g，在燒杯中用蒸餾水溶解，準(zhǔn)確定容至1000mL，高壓滅菌后儲存。

2） DMEM液配制：取DMEM干粉培養(yǎng)基溶于超純水中，磁力攪拌到充分溶解，加NaHCO3及雙抗 ，震蕩攪拌使之溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至 7.0～7.5，實驗室超純水補(bǔ)足至 1000 mL，用0.22 μmol/L 的濾膜過濾除菌，然后置于 4℃冰箱保存。用前加入胎牛血清調(diào)節(jié)至終濃度 10%。

3） MTT（5 mg/mL ） 液：精確稱取MTT 500 mg，加入到PBS液 100 mL中充分溶解后，經(jīng) 0.22 μmol/L的無菌濾膜過濾除菌，放置于-20℃保存。

4） 胰酶消化液配制：精密稱取胰蛋白酶0.8克，置于100mL的D-Hanks液中，使溶脹完全，然后定容至800mL，得胰蛋白酶溶液。過濾除菌，4℃保存，備用。

2.實驗方法

MTT比色法

含多柔比星結(jié)構(gòu)新化合物STL對人前列腺癌PC3細(xì)胞的作用

2.1細(xì)胞復(fù)蘇：

從液氮灌中取出凍存的裝有前列腺癌PC3細(xì)胞的凍存管，投入37℃的水浴箱中，并輕輕震動使其盡快融化，開封，用過火的槍頭吸出細(xì)胞懸液，注入到裝有9mLPPS離心管中，用1200r/min 低速離心5min，除去上清液，加入DMEM清洗棄上清液，然后再加入DMEM，用槍頭輕輕吹打至均勻散開使其成單細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記后放入到5%的37℃ CO2培養(yǎng)箱中，每日更換培養(yǎng)液。

2.2細(xì)胞傳代：

棄去舊的培養(yǎng)基加5mLPBS清洗2次，洗去懸浮的死亡細(xì)胞，加入已經(jīng)配制好的胰酶液，放到培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞1min，取出鏡下觀察細(xì)胞漂浮后，加入5mLDMEM終止細(xì)胞消化，反復(fù)輕輕吹打均勻，使其成為單細(xì)胞懸液，用1200r/min 低速離心，5min，去除上清液，加入DMEM，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，然后分裝到培養(yǎng)皿中，標(biāo)記后培養(yǎng)。

2.3 MTT法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實驗：

1 收集對數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，每孔加入100uL懸液，鋪板使待測細(xì)胞密度?10000/孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2 5%CO2、恒溫箱37℃孵育，至細(xì)胞在96孔板單層鋪滿孔底，加入梯度濃度的藥物及陽性對照藥物DOX濃度8μmol/L，藥物濃度設(shè)置為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，每孔100uL，設(shè)3復(fù)孔。

3 5% CO2恒溫37℃孵育72小時，倒置顯微鏡鏡下觀察。

4 每孔加入20uL MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。

5 終止培養(yǎng)，緩慢吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液。

6 每個孔中加入150uL DMSO，放在搖床上振蕩10min，觀察藍(lán)紫色的結(jié)晶物甲瓚充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD492nm處測量各組待測孔的吸光值。

7 同時根據(jù)以上設(shè)置調(diào)零孔（DMEM、二甲基亞砜、MTT）和對照孔（細(xì)胞、藥物溶解質(zhì)、DMEM、MTT、二甲基亞砜）。

3.含多柔比星結(jié)構(gòu)新化合物STL對人前列腺癌PC3細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)

通過實驗含多柔比星結(jié)構(gòu)新化合物STL同DOX比較對人前列腺癌PC3細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)，給與2μmol/L-8μmol/L的不同濃度受試藥物STL和8μmol/L濃度DOX，72小時各組別的作用：72小時STL組2μmol/L到8μmol/L組抑制率隨著劑量增加抑制率增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，相同給藥劑量8μmol/L比較，STL抑瘤率28%明顯高于DOX組19%（表1），STL對人前列腺癌PC3細(xì)胞的抑瘤率呈現(xiàn)隨著劑量增加而增加的劑量依賴性。

實驗總結(jié)

含多柔比星結(jié)構(gòu)新化合物STL是在多柔比星DOX的分子上加上一個敏感的靶向基團(tuán)，構(gòu)成了一個全新藥物，通過靜脈注射給藥，STL通過靶向基團(tuán)與機(jī)體血液中的白蛋白結(jié)合在血液及正常的細(xì)胞環(huán)境下比較穩(wěn)定，到達(dá)腫瘤組織后，由于腫瘤組織的特殊生長和代謝環(huán)境，靶向基團(tuán)對其敏感，通過細(xì)胞攝取作用進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞中，釋放出有細(xì)胞毒性的DOX，使腫瘤細(xì)胞凋亡，其實驗結(jié)果及機(jī)理表明抗腫瘤作用優(yōu)于多柔比星，是較DOX高效低毒的抗腫瘤藥物。

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院?吉林長春?130021）