付彥豐 楊鈺 張清榮 蔡明軍 徐海嬌 楊國程 單玉萍

摘?要?具有靶向性藥物遞送和可控釋放雙重優(yōu)勢的納米藥物是抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。 在納米藥物應(yīng)用中，藥效評估是非常重要的方面。本研究利用基于原子力顯微鏡（AFM）的納米壓痕技術(shù)，通過分析納米藥物作用后細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)（楊氏模量和粘彈性等）的改變，評估其藥效。結(jié)果表明，與游離的阿霉素（DOX）相比，DOX及喜樹堿（CPT）脂質(zhì)體納米藥物對宮頸癌（HeLa）細(xì)胞的藥效作用更明顯。進(jìn)一步檢測DOX和CPT不同摩爾比（4∶1和1∶4）混合的脂質(zhì)體納米藥物對HeLa細(xì)胞的藥效差異，發(fā)現(xiàn)在DOX和CPT的摩爾比為4∶1條件下，兩種藥物的協(xié)同作用增強(qiáng)了藥效。對納米藥物作用后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行粘彈性評估，發(fā)現(xiàn)隨著納米藥物作用時間的延長，細(xì)胞粘彈性隨之降低。本研究提供了一種簡單有效的篩選納米藥物的方法。

關(guān)鍵詞?原子力顯微鏡; 納米壓痕; 脂質(zhì)體; 納米藥物功效; 細(xì)胞力學(xué)

1?引 言

隨著納米藥物的發(fā)展，其在細(xì)胞內(nèi)的靶向遞送[1～3]、藥物緩釋[4～6]和改善藥物相容性[7]等方面顯示出明顯的優(yōu)勢。納米藥物是以納米材料作為載體的藥物，具有顆粒小、比表面積大、活性位點(diǎn)多、吸附性強(qiáng)等特點(diǎn)，通過高效的藥物遞送可延長藥物半衰期，并減少藥物對正常細(xì)胞的影響。近十幾年來，評估納米藥物功效與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系一直是研究熱點(diǎn)[8]。目前，一些方法已用于納米藥物功效的檢測，例如熒光素發(fā)光[9，10]、DNA凝膠電泳[11]和流式細(xì)胞術(shù)[12]。這些方法多通過測量藥物治療后細(xì)胞內(nèi)生物大分子的變化，反映納米藥物的功效。Shen等[13]利用流式細(xì)胞儀檢測小鼠成纖維細(xì)胞中活性氧含量的變化反映鐵-MIL-101-NH2納米藥物對細(xì)胞凋亡的影響。納米藥物作用后，受細(xì)胞骨架和功能蛋白影響的細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)會發(fā)生很大變化[14，15]，但是需要在生理條件下實(shí)時檢測細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的變化，才能更真實(shí)和確切地反映真實(shí)細(xì)胞中的情況。

已有研究者利用原子力顯微鏡（AFM）測量細(xì)胞膜的粗糙度，研究納米藥物功效[16，17]，而活體細(xì)胞膜成像的難度較大，一些細(xì)節(jié)變化難以檢測。作為AFM重要應(yīng)用的納米壓痕技術(shù)是測試材料力學(xué)性能最簡單的方法之一，可實(shí)時檢測活細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)[18～20]。細(xì)胞在生長、分化、凋亡、癌變及與鄰近細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)相互作用時，細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會產(chǎn)生明顯的變化[21，22]。在多數(shù)情況下，由于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和組織的改變，癌細(xì)胞（如膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌和卵巢癌[23-28]）比正常細(xì)胞具有更大的可變形性。實(shí)際上，細(xì)胞骨架密度的降低是肌動蛋白絲的部分缺失[29]或微管紊亂[30]的結(jié)果?；贏FM的納米壓痕技術(shù)可利用壓電陶瓷控制靈敏的微懸臂接觸細(xì)胞，在接觸細(xì)胞膜后，保持垂直位置的恒定壓力，通過記錄AFM微懸臂的偏轉(zhuǎn)，可檢測到細(xì)胞骨架因藥物作用而產(chǎn)生的細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞具有彈性，由微管和肌動蛋白支持，藥物的作用可引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞骨架被破壞，從而降低細(xì)胞的楊氏模量。Zhang等[31]利用AFM納米壓痕技術(shù)檢測了西妥昔單抗的抗癌效果。作為廣譜抗癌藥物，阿霉素（DOX）和喜樹堿（CPT）可用于制備脂質(zhì)體納米藥物[32，33]，其藥效評估尤為重要。

本研究通過分析不同濃度DOX和CPT脂質(zhì)體納米藥物與細(xì)胞孵育不同時間后細(xì)胞的力學(xué)性能改變來評估納米藥物的功效。在不同條件下，經(jīng)納米藥物處理后，測量了細(xì)胞的反饋力、壓痕深度與楊氏模量; 同時，分析了與納米藥物共孵育不同時間后細(xì)胞的粘彈性，以評價納米藥物的功效。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌（HeLa）細(xì)胞由中國科學(xué)院上海干細(xì)胞庫提供。細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco Modified Eagle Hyclone）中，于37℃，5% CO2氣氛中培養(yǎng)。將10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、200 U/mL鏈霉素和BIOMYC-3（以色列Biological Industries）抗生素溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。將具有高硬度的22 mm × 22 mm石英玻璃蓋玻片加入到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，獲得約70%的細(xì)胞生長密度后，進(jìn)行納米壓痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，用1000 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，8.0 g NaCl、3.4785 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4溶于1000 mL蒸餾水）清洗3次，用無血清的DMEM培養(yǎng)液再潤洗一次，之后在培養(yǎng)皿中加入2 mL無血清的MEM培養(yǎng)液，進(jìn)行納米壓痕實(shí)驗(yàn)。

2.2?壓痕實(shí)驗(yàn)

利用Agilent AFM 5500（美國Agilent Technologies公司）在37℃恒溫加熱臺上進(jìn)行納米壓痕實(shí)驗(yàn)。將直徑約5 μm的聚苯乙烯微球粘到AFM探針微懸臂上（MSCT，A針，標(biāo)定彈性常數(shù)為0.068 N/m）。以2 μm/s的速度進(jìn)行力-壓痕曲線測量，掃描范圍2 μm[31]。在納米壓痕實(shí)驗(yàn)過程中，探針接觸細(xì)胞表面后，控制壓電陶瓷繼續(xù)運(yùn)動1.3 μm，使微球充分接觸細(xì)胞[34]。微球盡量壓在細(xì)胞核周圍相對平坦區(qū)域內(nèi)。每個實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組測試5個細(xì)胞，并收集約1000條力-壓痕曲線，共15個細(xì)胞，約3000條力-壓痕曲線。

2.3?楊氏模量計算

依據(jù)文獻(xiàn)報道的方法測算AFM探針微懸臂的彈性常數(shù)[35]，根據(jù)胡克定律計算加載力[36]：

其中，F(xiàn)0是加載力，k是帶有微球的AFM探針微懸臂彈性常數(shù)，Δz是在納米壓痕測試過程中檢測到的AFM探針微懸臂的Z軸方向的位移變化。楊氏模量通過赫茲模型計算獲得，模型假設(shè)壓痕區(qū)域較小時，該區(qū)域是連續(xù)且不可壓縮的。研究證明，該模型可用于計算細(xì)胞彈性，計算方法見公式（2）[37]：

其中，E是楊氏模量，是壓痕深度，R是微球半徑，v是泊松比。細(xì)胞被認(rèn)為是線性、彈性、各向同性、不可壓縮的，并且應(yīng)變值較小，因此，泊松比為0.5。F（d）是當(dāng)微球壓在細(xì)胞上AFM探針微懸臂由于細(xì)胞的彈性而彎曲產(chǎn)生的反饋力。根據(jù)胡克定律計算F（d）：

其中，Δd是當(dāng)將微球壓在細(xì)胞表面上時產(chǎn)生的撓度變化。利用軟件Atomic J計算楊氏模量和反饋力。

2.4?脂質(zhì)體納米藥物的制備

將卵磷脂（0.1 mmol/L）和膽固醇（0.1 mmol/L）溶解在3 mL氯仿中，將每500 μL溶液分裝成一個樣品，并用氬氣干燥; 在真空干燥器中進(jìn)一步過夜干燥，以去除有機(jī)溶劑，獲得脂質(zhì)體。為了裝載藥物，將脂質(zhì)體與含有1 mmol/L DOX或CPT的1 mL PBS緩沖液水合，并在65℃下將脂質(zhì)體和藥物完全混合。將懸浮液在80℃的超低溫冰箱中保持1 min，使懸浮液固化，并在室溫下融化，轉(zhuǎn)移至65℃的水浴中，并充分渦旋混合，重復(fù)上述過程5次。為了控制脂質(zhì)體囊泡的尺寸，在脂質(zhì)體制備裝置（Avanti）中安裝了兩層150 nm的聚碳酸酯濾膜?？刂茰囟葹?5℃，使脂質(zhì)體在高溫下擠出，并重復(fù)20次。最后，制得直徑約150 nm的載藥脂質(zhì)體[38]。

3?結(jié)果與討論

3.1?AFM納米壓痕技術(shù)評估藥效的可行性

細(xì)胞膜上進(jìn)行基于AFM的納米壓痕測量的示意圖如圖1A所示。AFM探針接觸細(xì)胞膜后，壓電陶瓷繼續(xù)向下移動恒定的距離，對細(xì)胞施壓，導(dǎo)致AFM探針微懸臂偏轉(zhuǎn)[34]，該偏轉(zhuǎn)可由光電探測器記錄并繪制力-壓痕曲線。由于每種藥物的特性不同，對細(xì)胞凋亡的影響也不同[39]。DOX是一種廣譜抗癌藥物，可抑制DNA的合成，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，顯示出對癌癥的良好治療效果[40]。DOX處理后，癌細(xì)胞的細(xì)胞膜硬度會降低[41]。因此，本研究選擇DOX作為模型分子，檢測基于AFM納米壓痕技術(shù)分析藥物功效的可行性。

圖1B和1C分別為用不同濃度DOX和不同處理時間后HeLa細(xì)胞上的典型力-壓痕曲線。橫坐標(biāo)表示壓痕的深度，縱坐標(biāo)表示反饋力，該力是在進(jìn)行納米壓痕測量時由AFM探針懸臂的撓度變化轉(zhuǎn)換而來的。在“0.0”點(diǎn)處，探針無限靠近細(xì)胞（接觸點(diǎn)），隨著壓痕深度的增加，AFM探針懸臂的撓度增大。與未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞（Control，反饋力為（1.58±0.07） nN，0.15 μm壓痕處，曲線的最高點(diǎn)）相比，用0.5 mmol/L DOX處理細(xì)胞1 h后，反饋力降到（1.25±0.05） nN（0.34 μm壓痕處）。壓痕深度增加表明細(xì)胞變軟，這是由于凋亡的癌細(xì)胞硬度降低[42]。隨著處理細(xì)胞DOX濃度的增加，反饋力減小。將細(xì)胞與3 mmol/L的DOX共同孵育1 h后，反饋力僅為（0.35±0.07） nN（0.81 μm壓痕處）。同時，反饋力也會隨著處理細(xì)胞時間的延長而減小。值得注意的是，處理細(xì)胞4 h（0.5 mmol/L）后，反饋力雖然降低至（0.30±0.07） nN，但是壓痕深度減小到0.55 μm，這可能是由于凋亡過程中細(xì)胞質(zhì)收縮和凋亡小體的出現(xiàn)，阻礙了探針的下降[43]。計算了上述條件下HeLa細(xì)胞的楊氏模量（圖1D），與HeLa細(xì)胞共孵育的DOX濃度從0 mmol/L增加到3 mmol/L（共孵育1 h），細(xì)胞的楊氏模量從（3480.21±398.36） Pa降到（1376.52±71.98） Pa。孵育時間從1 h延長到4 h（DOX濃度0.5 mmol/L），細(xì)胞的楊氏模量從（2838.19±71.85） Pa降到（1061.14±71.88） Pa。上述結(jié)果表明，藥物治療后，細(xì)胞骨架塌陷，細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞楊氏模量和反饋力的降低[44]，證明了AFM納米壓痕檢測藥物功效的可行性。

3.2?基于AFM納米壓痕技術(shù)評估納米藥物功效

通過改變藥物親和力，可加快細(xì)胞吞噬作用，因此，脂質(zhì)體納米藥物受到越來越多的關(guān)注[45]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了基于AFM的納米壓痕技術(shù)分析納米藥物功效的可行性。通過機(jī)械擠壓法合成了載有DOX（LDOX）和CPT（LCPT）的脂質(zhì)體納米藥物[46]。納米壓痕測量發(fā)現(xiàn)，隨著與細(xì)胞共孵育LDOX濃度的增加（0～0.5 mmol/L，1 h），細(xì)胞的楊氏模量從（3483.34±431.05） Pa降低到（1402.67±67.20） Pa。將細(xì)胞與LDOX（0.25 mmol/L）共孵育3 h后，細(xì)胞的楊氏模量從（2454.42±66.69） Pa（0.25 mmol/L，0.5 h）降低到（661.44±66.27） Pa（圖2A）。對于不同濃度LCPT處理不同時間的細(xì)胞，楊氏模量分別從（2262.11±67.46） Pa降至（1349.71±66.61） Pa（0.125～0.5 mmol/L，1 h），以及從（2365.55±66.95） Pa降至（654.42±65.61） Pa（0.5～3.0 h，0.25 mmol/L，圖2B）。因此，LCPT的作用與LDOX相似，這種類似的作用提供了兩種藥物在脂質(zhì)體中混合使用的可能性。

DOX和CPT混合的納米藥物可通過協(xié)同作用發(fā)揮更好的效果，但是DOX和CPT不同濃度比制得的混合藥物可能顯示出不同的藥效。研究表明，DOX和CPT以摩爾比4∶1混合后藥效較好，而以摩爾比1∶4混合的藥效相對差一些[47]。將DOX和CPT以4∶1和1∶4（摩爾比）混合的脂質(zhì)體納米藥物分別命名為L4∶1和L1∶4。在不同濃度和時間條件下分別檢測了L4∶1和L1∶4的藥物功效。如圖2C和2D所示，細(xì)胞的楊氏模量隨著共孵育時間的延長及L1∶4和L4∶1濃度的增加而降低。不同條件下，藥物處理HeLa細(xì)胞后細(xì)胞的楊氏模量見表1。通過比較發(fā)現(xiàn)，L4∶1和L1∶4納米藥物均具有協(xié)同作用。在低濃度（0.125 mmol/L，1 h）下，LDOX（（2333.51±68.67） Pa）的藥效略優(yōu)于L1∶4（（2427.03±67.43） Pa）; 對于較長的共孵育時間（0.25 mmol/L，3 h），LDOX（（661.44±66.27） Pa）的藥效也優(yōu)于L1∶4（（770.58±67.40） Pa）。推測在低濃度下，這兩種藥物會發(fā)生相互作用，從而抑制藥效; 而隨著孵育時間延長，藥物的濃度降低，兩種藥物也會發(fā)生相互作用而產(chǎn)生拮抗，與文獻(xiàn)[40]報道結(jié)果相似。

將不同組分的納米藥物在相同的藥物濃度與孵育時間下進(jìn)行藥效對比（圖3）。通過細(xì)胞楊氏模量的比較可反映藥物功效趨勢：游離藥物<脂質(zhì)體納米藥物<混合脂質(zhì)體納米藥物，此結(jié)論與文獻(xiàn)[48]一致，這是因?yàn)橹|(zhì)體的生物相似性可促進(jìn)藥物的吸收，進(jìn)而增強(qiáng)藥效[49]。同時，在低濃度和較長孵育時間條件下，兩種藥物存在拮抗作用，會出現(xiàn)混合脂質(zhì)體納米藥物功效比單一脂質(zhì)體納米藥物功效差的現(xiàn)象。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了基于AFM納米壓痕技術(shù)評估納米藥物功效的可行性。

3.3?測量細(xì)胞粘彈性評估納米藥物功效

粘彈性可反映細(xì)胞活力，基于AFM的力-距離曲線可用于評估細(xì)胞的粘彈性行為。對于純彈性物體，逼近曲線和縮回曲線在力-距離曲線中重疊。然而，在細(xì)胞上測量力-距離曲線的過程中，細(xì)胞膜的收縮因細(xì)胞塑性的增加而被抑制，在接近曲線和回縮曲線之間會有很大的間隙。為了量化細(xì)胞與納米藥物共孵育之前和之后的塑性，在用0.5 mmol/L L4∶1處理不同時間的HeLa細(xì)胞上進(jìn)行了力-距離曲線測量。相對彈塑性行為用塑性指數(shù)ζ描述，塑性指數(shù)ζ可通過逼近曲線（A1）下的積分面積與縮回曲線（A2）下的積分面積之比確定（圖4）[18，50]：

典型的力-距離曲線如圖5A所示。通過積分面積比擬合獲得細(xì)胞塑性指數(shù)。當(dāng)逼近曲線和縮回曲線重合時，A1=A2，細(xì)胞處于完全彈性狀態(tài)，塑性指數(shù)ζ=0。如果A2=0，則細(xì)胞格是完全塑性的，ζ=100%。通常，細(xì)胞中，0<ζ<100%，它指示細(xì)胞的粘彈性行為[50]。對于空白脂質(zhì)體（對照）處理的HeLa細(xì)胞，ζ0=25.11%±1.43%。與L4∶1（0.5 mmol/L）共同孵育0.5、1、2和3 h后，細(xì)胞的粘彈性分別為37.22%±1.48%、30.05%±1.37%、40.92%±0.91%和43.99%±1.37%（圖5B）。0.5 mmol/L L4∶1處理細(xì)胞0.5 h后，由于粘著蛋白破壞了細(xì)胞膜表面，細(xì)胞的粘彈性先增加; 當(dāng)孵育時間延長至1 h，粘彈性又降低。這是因?yàn)殡S著表面張力的增加，細(xì)胞從扁平變?yōu)榍蛐?，?dǎo)致暫時的彈性恢復(fù)（塑性降低）; 隨著共同孵育時間的延長（2～3 h），內(nèi)部細(xì)胞骨架坍塌，細(xì)胞質(zhì)濃度增加，塑性值逐漸增高[51]。上述結(jié)果進(jìn)一步表明了細(xì)胞的粘彈性用于分析納米藥物功效的直觀效果。

4?結(jié) 論

通過AFM納米壓痕技術(shù)檢測細(xì)胞的力學(xué)性能（包括反饋力、 壓痕深度、 楊氏模量和粘彈性），實(shí)現(xiàn)了對納米藥物功效的分析。以DOX處理的細(xì)胞上驗(yàn)證基于AFM納米壓痕技術(shù)分析藥物功效的可行性，分別研究了脂質(zhì)體包裹的DOX、CPT以及CPT和DOX混合物的納米藥物功效。進(jìn)一步驗(yàn)證了AFM納米壓痕技術(shù)分析納米藥物功效的可行性，發(fā)現(xiàn)在多數(shù)情況下，藥物功效順序?yàn)椋河坞x藥物<脂質(zhì)體納米藥物<混合脂質(zhì)體納米藥物，但在低濃度和長時間作用條件下，兩種藥物存在拮抗作用。通過測量比較了L4∶1處理不同時間后細(xì)胞的粘彈性，并進(jìn)行了納米藥物功效評估。本研究為納米藥物篩選提供了一種有效的新方法。

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