李 淼 侯靈芝 徐興浩 王肖肖 鄭明燦 劉 昂

(濟寧醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,濟寧 272067)

肽聚糖是細菌細胞壁的特有組分，其水解酶作用靶點是細胞壁中肽聚糖成分的酶類物質(zhì)，也稱為溶素(lysin)，具有裂菌殺菌能力，是潛在的抗菌武器，受到了較多的關(guān)注[1-2]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是常見的引起人化膿性感染的病原菌?？梢饌诘幕撔愿腥?、肺炎、敗血癥等，嚴重者會危及生命[3]。金黃色葡萄球菌極易產(chǎn)生耐藥性變異，例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌現(xiàn)已經(jīng)成為患者死亡的重要病原菌[4]。開發(fā)新型的殺菌藥物迫在眉睫。本研究以金黃色葡萄球菌肽聚糖為底物，從海洋沉積物中篩選能夠水解胞外肽聚糖的細菌菌株，以金黃色葡萄球菌的菌體為底物對8株細菌進行了發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，并檢測了粗酶液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1沉積物樣品 分離菌株所用的沉積物樣品是用無菌的50 mL離心管采集自日照附近黃海海域的潮間帶(35°28' N 119°36'E)，低溫運輸?shù)綄嶒炇也⒂?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC 27217T)購自Solarbio公司，在實驗室中接種LB培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.1.3培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基[1%胰蛋白胨(Oxoid公司)，0.5% 酵母浸出物(Oxoid公司)，1.5%瓊脂(Biosharp公司)，蒸餾水，pH 7.5]。

TYS 培養(yǎng)基(0.5%胰蛋白胨，0.1% 酵母浸出物，1.5%瓊脂，人工海水，pH 7.5)。

肽聚糖水解酶篩選平板(0.5%胰蛋白胨，0.1% 酵母浸出物，1.5%瓊脂，人工海水，1% 金黃色葡萄球菌肽聚糖，pH 7.5)。

以金黃色葡萄球菌菌體為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基(2%金黃色葡萄球菌體，人工海水，pH 8.0)。

1.2 方法

1.2.1金黃色葡萄球菌肽聚糖提取 將500ml金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物，8000rpm 離心2min收集菌體，蒸餾水重懸，離心洗滌1次，倒掉上清液；用100ml蒸餾水重懸菌體；將樣品煮沸10min，然后10000rpm 離心8min收集菌體；用預(yù)熱的5%(w/v)的SDS緩沖液重懸菌體，煮沸40min，不可溶物通過離心(10000rpm,15min)重新收集；用預(yù)熱的(60℃)蒸餾水洗滌菌體以去除SDS，離心洗滌6次；利用超聲破碎細胞，間隔5s，破碎5s，功率400W，99次每輪，破碎4輪；將樣品4000rpm離心10min，去掉未破碎的菌體，保留上清，12000rpm離心10min收集破碎的細胞壁并水洗2次即得到肽聚糖。

1.2.2肽聚糖水解酶分泌菌株的初篩 將1g沉積物樣品和9ml的無菌人工海水懸浮加入三角瓶中，另加入10顆直徑為1mm的無菌小玻璃球，于25℃、200r/min震蕩1h。之后取懸浮液梯度稀釋后涂布肽聚糖水解酶篩選平板，置于25℃靜置培養(yǎng)10d，選取周圍有透明圈的菌落分離純化，用于后續(xù)實驗。

1.2.3所篩選菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長情況分析 將篩選到的能在肽聚糖水解酶篩選平板上產(chǎn)生透明圈的菌株接種到以金黃色葡萄球菌菌體為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d后鏡檢觀察生長結(jié)果，選取能夠在該種發(fā)酵培養(yǎng)基中明顯生長的菌株用于進一步研究。

1.2.4所篩選菌株16S rRNA基因序列測定和同源比對 將篩選的能分泌肽聚糖水解酶且能夠在以金黃色葡萄球菌菌體為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長的菌株，利用基因組小量提取試劑盒提取其基因組。之后利用細菌16S rRNA基因擴增通用引物27F和1492R擴增其16S rRNA基因片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后連接到PMD-19T克隆質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株后寄送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將得到的序列在EzBioCloud網(wǎng)站同源比對，分析其分類學地位。

1.2.5所篩選菌株粗酶液的制備 將篩選到的8株菌株接種以金黃色葡萄球菌菌體為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d后，12000rpm離心5min后收集上清液即為粗酶液。

1.2.6粗酶液抑菌活性測定 平板菌落計數(shù)法：1)挑取金黃色葡萄球菌到LB液體培養(yǎng)基，于25℃、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)5h。吸取1ml培養(yǎng)物離心收集菌體，之后用1ml 0.5mM的PBS緩沖液重懸制備菌懸液。2)實驗組吸取200μl制備好的菌懸液，與200μl粗酶液混勻，30℃環(huán)境下反應(yīng)40min；對照組操作與實驗組僅有一處不同，即粗酶液先沸水浴1min后再與菌懸液混勻反應(yīng)。3)反應(yīng)后，將對照組與實驗組反應(yīng)液進行梯度稀釋到1×10-8、1×10-9、1×10-10，稀釋液為LB液體培養(yǎng)基。之后將稀釋后的反應(yīng)物涂布固體LB培養(yǎng)基， 37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h后，計數(shù)對照組與實驗組的菌落個數(shù)。顯微鏡觀察：將平板菌落計數(shù)法步驟中第二步粗酶液和菌懸液的反應(yīng)產(chǎn)物，取3μl涂布載玻片，革蘭染色后油鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 分泌肽聚糖水解酶菌株篩選

在肽聚糖篩選平板上經(jīng)過兩周的培養(yǎng)，長出了很多的菌落，但是僅有15株細菌菌落周圍產(chǎn)生了明顯的透明水解圈，表明這15株細菌能夠分泌肽聚糖水解酶。我們將這15株細菌進一步純化后制作甘油管保種備用。

2.2 所篩選菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長情況

經(jīng)過培養(yǎng)檢測，發(fā)現(xiàn)所篩選到的15株能分泌肽聚糖水解酶的菌株中，有8株可以在金黃色葡萄球菌菌體為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長。這8株細菌菌株具有較低成本下進一步擴大發(fā)酵產(chǎn)酶的可行性，有潛在的應(yīng)用價值。

2.3 所篩選菌株16S rRNA基因序列測定和同源比對結(jié)果

為初步確認本實驗篩選到的8株有潛在應(yīng)用價值的細菌菌株的分類地位，我們對這些菌株的16S rRNA基因序列進行了測定，并將獲得的序列進行同源比對。結(jié)果表明，這8株細菌均屬于芽孢桿菌屬,物種豐富度較低。見表1。

表1 8株細菌菌株16S rRNA基因序列同源比對

2.4 粗酶液抑菌活性初步測定

與對照組相比，經(jīng)過粗酶液處理過的金黃色葡萄球菌的菌落形成單位均大幅下降。對金黃色葡萄球菌抑菌效果最顯著的是菌株S213，實驗組的菌落形成單位下降了95.0%。而對金黃色葡萄球菌抑菌效果相對最差的是菌株S324，實驗組的菌落形成單位下降了61.9%。其他6株細菌粗酶液的實驗組菌落形成單位下降了78.6%～93.5%，均展示出了良好的抑制金黃色葡萄球菌的能力。見圖1、表2。

表2 粗酶液處理過的金黃色葡萄球菌的菌落形成單位下降比例

2.5 粗酶液的殺菌能力

與對照組相比，經(jīng)粗酶液作用后，實驗組金黃色葡萄球菌數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)了一些輪廓不清晰的碎片樣物質(zhì)；實驗組金黃色葡萄球菌的排列方式也不再是葡萄串狀，而是單球、雙球或者短鏈樣不規(guī)則排列。粗酶液能夠裂解金黃色葡萄球菌，大幅度減少其數(shù)量并導(dǎo)致其排列方式發(fā)生變化。見圖2。

注：每菌株對應(yīng)兩張圖片，左邊圖片為對照組，右邊圖片為實驗組，菌株編號在圖片組的上方。

注：左邊圖片為對照組，右邊圖片為實驗組。圖中的標尺代表的長度為5μm。

3 討論

細菌的耐藥問題越來越嚴重，據(jù)調(diào)查顯示，在全世界范圍內(nèi)，有700000人因細菌耐藥而喪生。如果細菌耐藥問題不能解決，到2050年將導(dǎo)致與感染有關(guān)的死亡超過癌癥引起的死亡。肽聚糖水解酶也稱為溶素，可根據(jù)其來源和功能分為外溶素(exolysin)、內(nèi)溶素(endolysin)和自溶素(autolysin)[5-7]。具有裂菌功能的主要是肽聚糖水解酶中的外溶素和自溶素[8]。而肽聚糖水解酶與傳統(tǒng)抗菌藥物不同[9]，通過裂解細胞壁肽聚糖從而裂解殺菌，是潛在的抗菌武器，具有良好的應(yīng)用前景[10-13]。

鑒于細菌分泌肽聚糖水解酶多為誘導(dǎo)型，如若希望通過液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶，需要添加肽聚糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)酶。但商品化的肽聚糖價格昂貴，而在實驗室提純過程繁瑣，成本高，均不適用于之后的大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)酶，本實驗為解決這一問題，嘗試直接將金黃色葡萄球菌菌體作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一有機物來培養(yǎng)所篩選出的產(chǎn)酶菌株，金黃色葡萄球菌菌體上的肽聚糖即可作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

本研究從山東日照海域沉積物樣品中，以金黃色葡萄球菌肽聚糖為底物篩選出了15株能分泌肽聚糖水解酶的菌株。我們進一步的實驗表明其中有8株可以在以金黃色葡萄球菌為唯一有機物的培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)酶，這8株菌具有低成本發(fā)酵生產(chǎn)肽聚糖水解酶的應(yīng)用潛力。通過16S rRNA基因序列比對分析，我們選擇的8株菌均為芽孢桿菌屬細菌。芽孢桿菌屬菌株是分離肽聚糖水解酶的良好來源。將選取的8株芽孢桿菌進行以金黃色葡萄球菌為底物的發(fā)酵培養(yǎng)后，制取粗酶液，通過平板菌落計數(shù)法測定菌株粗酶提取液的抑菌活性，結(jié)果表明8株芽孢桿菌屬菌株對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，并且通過顯微鏡觀察證實了粗酶液的殺菌能力。本研究所篩選到的菌株及探索出來的低成本發(fā)酵產(chǎn)酶方法，為下一步分離純化肽聚糖水解酶，開發(fā)新型抗菌藥物奠定了堅實的基礎(chǔ)。