范紫微，古 虹，鄒天琪，柏 琳，孫靖輝，張成義

（北華大學藥學院，吉林 吉林 132013）

RA模型分為多種，但最為經(jīng)典的是弗氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant，CFA）誘導的佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠模型［4］。AA模型大鼠癥狀與RA患者的臨床癥狀接近，故本研究采用AA大鼠模型進行研究。

北五味子是長白山道地藥材，同時也是常用的傳統(tǒng)中藥材之一，在我國《藥典》中列為滋補和鎮(zhèn)靜中藥，具有益氣生津、補腎養(yǎng)心、收斂、固澀的功效，已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)多種處方及與之相關(guān)的保健品和復方制劑中，如肝得安、五味子蜜丸、北五味子茶、納米參芪五味子制劑、北五味子片和五酯膠囊等［5］。五味子木脂素（Schisandra chinensislignans，SCL）是中藥五味子的主要活性成分，中醫(yī)以五味子入藥治療RA。近年研究發(fā)現(xiàn)，SCL具有較強的體外抗炎活性［6］，但其抗炎作用與自噬相關(guān)基因的相關(guān)性未見報道。本研究擬通過SCL干預(yù)AA大鼠，探討SCL對AA大鼠的抗炎作用及對自噬相關(guān)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

SCL，由北華大學藥學院制備（純度90.6%）。具體制備過程見文獻［7］。將干燥的五味子粉碎并過篩，用95%乙醇連續(xù)2次回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥濾液。將干燥的樣品溶解在適量的蒸餾水中，過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，并向提取物中添加適量的蒸餾水，用大孔樹脂填充柱，洗脫提取物。收集乙醇洗脫液用于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥。最后，獲得SCL粉末，每1 g五味子含有10.9 mg木脂素。

地塞米松（dexamethasone，Dex）片（廣東華南藥業(yè)集團有限公司）；CFA（編號：76J00110，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；兔抗大鼠AMPK單克隆抗體、兔抗大鼠mTOR多克隆抗體、兔抗大鼠Beclin1多克隆抗體和兔抗大鼠輕鏈3-Ⅱ（light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）多克隆抗體（英國Abcam公司）；兔抗大鼠自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，ATG5）、ATG7和ATG12多克隆抗體（中國武漢AB clonal公司）；辣根過氧化物標記山羊抗兔各蛋白IgG抗體，GAPDH、白細胞介素6（interleu?kin-6，IL-6）、IL-1β、IL-17、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、環(huán)氧合酶1（cyclooxygen?ase-1，COX-1）、COX-2、AMPK、mTOR、Beclin1、LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7和ATG12引物（北京鼎國公司）；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和高純總RNA快捷提取試劑盒（購于美國BioTake公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海翊圣生物科技公司）。

酶標儀（680，美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（E-Gellmager，美國莫賽飛公司）；PCR儀（Master?cycler X50，德國Eppendorf有限公司）；電泳儀（JY200C，上海珂淮儀器有限公司）；切片機（RM2235）和石蠟包埋機（EG1150，德國徠卡有限公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（MG8000，托摩根生物科技有限公司）；足跖容積測量儀（PV-200，成都泰盟有限公司）。

1.2 動物、AA模型制備和分組

60只雄性Wistar大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量200～210 g（長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司提供）。在SPF條件下動物室飼養(yǎng)，室溫24℃和相對濕度45%～55%。實驗開始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實驗設(shè)計及實驗操作由北華大學動物倫理委員會審查和批準。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，每組10只。正常對照組、模型組、模型+Dex 0.25 mg·kg-1組、模型+SCL 25，50和100 mg·kg-1組。以造模當天為實驗第0天（D0），正常對照組大鼠右后足足跖皮下注射器0.2 mL生理鹽水，其余50只大鼠注射CFA 0.2 mL［8］。8 h 后，大鼠致炎足足腫脹度均大于0.8 mL，認為造模成功。D1開始，正常對照組和模型組ig給予生理鹽水，其余組大鼠ig給予相應(yīng)藥物，每天1次，持續(xù)28 d。測D0和D28大鼠體質(zhì)量，觀察并記錄其體質(zhì)量變化。

香豆素對小麥發(fā)芽指數(shù)、種子萌發(fā)、幼苗生長及根系活力有抑制作用，且隨處理濃度的增加而增強，肉桂酸、羥基苯甲酸和苜蓿素在處理濃度大于0.010 g/L之后抑制作用逐漸明顯。

1.3 觀察AA大鼠足跖形態(tài)變化

觀察1.2分組大鼠D0，D21和D28致炎足跖形態(tài)變化，觀察大鼠非致炎足是否出現(xiàn)繼發(fā)反應(yīng)及繼發(fā)反應(yīng)高峰，拍照記錄。

1.4 排水法檢測AA大鼠足跖腫脹

實驗期間，每4 d測1.2分組大鼠右后足足跖的容積，計算各組大鼠足跖腫脹度。足腫脹度（mL）=Vt-V0，式中V0和Vt分別代表致炎前后足組織容積值。

1.5 檢測AA大鼠胸腺和脾指數(shù)

最后1次給藥后1 h，取1.2分組大鼠稱重，ip給予25%烏拉坦（4 mg·kg-1）麻醉處死，立即取胸腺和脾，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干水分并稱重，計算胸腺和脾指數(shù)［9］。胸腺或脾指數(shù)=胸腺或脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.6 HE染色法觀察AA大鼠關(guān)節(jié)組織病理改變

取1.2分組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)給予10%中性甲醛固定后，用10%EDTA脫鈣，每4 d更換1次脫鈣液，脫水24 h；石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，HE染色。光學顯微鏡觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)變化并進行病理評分，分別半定量檢測炎癥細胞、滑膜組織增生和OOCHAS［10］評分。炎癥細胞評價評分標準：0分，無；1分，稀疏、散在；2分，較密集；3分，大量?；そM織增生評分標準：0分，無；1分，單層；2分，2層；3分，3層。OOCHAS評分=關(guān)節(jié)軟骨損傷深度及相應(yīng)組織反應(yīng)分級（0～6級）×關(guān)節(jié)軟骨損傷范圍分期（0～4期）；分級評分標準為：0級：關(guān)節(jié)面完整，軟骨完整；1級：表面完整；2級：表面不連續(xù)；3級：垂直裂隙；4級：糜爛；5級：缺損；6級：變形；分期評分標準為：0期：無炎癥表現(xiàn)；1期：損傷面積小于樣本面積10%；2期：損傷面積占樣本面積10%～25%；3期：損傷面積占樣本面積25%～50%；4期：損傷面積大于樣本面積50%。

1.7 RT-PCR法檢測AA大鼠足跖關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥相關(guān)因子和自噬相關(guān)基因mRNA表達水平

取1.2分組大鼠右后足致炎足跖滑膜組織，使用RNA提取試劑盒提取大鼠致炎足跖滑膜組織總RNA。然后以總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄，提取cDNA。操作步驟如下：42℃孵育50 min和72℃孵育10 min，逆轉(zhuǎn)錄cDNA；RT-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2 Taq Master mix 12.5 μL、雙蒸水 9.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL和cDNA 1 μL 。

PCR擴增以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在94℃3 min的條件進行初始變性，經(jīng)20個循環(huán)，94℃30 s變性，65℃30 s退火和72℃1 min延伸過程，72℃ 10 min充分延伸；依次點樣，100 V、40 min電泳，通過2%瓊脂糖和Gelred電泳1 h和凝膠成像分析系統(tǒng)觀察擴增產(chǎn)物，進行目的基因mRNA的半定量分析，以目的基因條帶與GAPDH條帶吸光度比值進行數(shù)據(jù)分析（PCR引物序列見表1）。以上實驗至少重復3次。

1.8 Western印跡法檢測AA大鼠足跖關(guān)節(jié)滑膜組織AMPK，mTOR，Beclin1，LC3-Ⅱ，ATG5，ATG7和ATG12蛋白表達水平

取1.2分組大鼠右后足致炎足跖滑膜組織，配制裂解緩沖液、PMSF和磷酸酶抑制劑工作液，用于大鼠致炎足跖滑膜組織總蛋白的提取。BCA蛋白濃度測定試劑盒對提取蛋白質(zhì)進行定量分析。配制濃縮膠、分離膠（12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠）；上樣50 μg蛋白進行電泳（80 V 30 min，100 V 1.5 h）；轉(zhuǎn)模（PVDF膜，100 V 1 h）；封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；孵育一抗，4℃過夜：用TBST稀釋兔抗大鼠 AMPK、mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、ATG12和 GAPDH抗體（1∶1000稀釋）；回收一抗，用TBST洗膜3次，每次10 min；孵育HRP標記山羊抗兔IgG（二抗）（1∶10 000稀釋）室溫1 h；用TBST洗3次，每次10 min；采用增強化學發(fā)光底物試劑盒進行免疫檢測。GAPDH作為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件對蛋白條帶的積分吸光度進行定量分析。以目標蛋白條帶與內(nèi)參條帶積分吸光度值比值表示目標蛋白的相對表達水平。

Tab.1 Sequence of primers for RT-PCR

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SCL對AA大鼠體質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示（表2），D28，與正常對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，模型+SCL 50和100 mg·kg-1組可明顯增加大鼠體質(zhì)量（P＜0.01），模型+SCL 100 mg·kg-1組大鼠體質(zhì)量接近正常對照組。模型+Dex組與模型組相比，AA大鼠的體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of Schisandra chinensis lignans（SCL）on body mass of adjuvant arthritis（AA）model rats

2.2 SCL對AA大鼠足跖形態(tài)變化的影響

D1，注射CFA的大鼠足跖紅腫明顯。D28，模型組足跖腫脹明顯，模型+SCL 25，50和100 mg·kg-1組大鼠致炎足跖腫脹明顯減輕。D21，大鼠繼發(fā)性炎癥達到高峰。未發(fā)現(xiàn)注射弗氏佐劑的非致炎足出現(xiàn)紅腫（圖1）。

Fig.1 Effect of SCL on morphological changes of feet in AA model rats.See Tab.2 for the rat treatment.

2.3 SCL對AA大鼠足腫脹的影響

與模型組相比，模型+SCL組大鼠的足跖腫脹度明顯減輕（圖2）。D4開始，模型+SCL 100 mg·kg-1組大鼠足跖腫脹度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。從D24開始，模型+SCL 50 mg·kg-1組大鼠足跖腫脹度明顯降低（P＜0.05）。模型+Dec組大鼠從D4開始足跖腫脹度顯著降低（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of SCL on foot swelling in AA model rats.See Tab.2 for the rat treatment.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.4 SCL對AA大鼠胸腺和脾指數(shù)的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SCL 25，50和100 mg·kg-1組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.01），模型+Dex組胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。與正常對照組相比，模型組大鼠脾指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SCL50和100mg·kg-1組大鼠脾指數(shù)明顯降低（P＜0.01），模型+Dex組大鼠脾指數(shù)顯著降低（P＜0.01）（表3）。

Tab.3 Effect of SCL on thymus and spleen index of AA model rats

2.5 SCL對AA大鼠關(guān)節(jié)組織的影響

HE染色結(jié)果顯示（圖3），正常對照組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，軟骨襯里、關(guān)節(jié)間隙及骨組織形態(tài)正常，滑膜內(nèi)無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠關(guān)節(jié)組織高度異常，滑膜明顯增生，炎癥細胞浸潤，血管擴張。半定量關(guān)節(jié)病理評分結(jié)果顯示，模型組炎癥細胞評分、滑膜組織增生和OOCHAS評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+Dex 0.25 mg·kg-1組大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥細胞浸潤減少，炎癥細胞評分明顯降低（P＜0.01），血管擴張減少，滑膜組織增生顯著降低（P＜0.01），趨于正常，軟骨和骨侵蝕顯著減輕，OOCHAS評分顯著降低（P＜0.01）；模型+SCL 25 mg·kg-1組各病變改善不明顯，模型+SCL 50 mg·kg-1組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)基本恢復正常，炎癥細胞浸潤減少，炎癥細胞評分明顯降低（P＜0.05）；模型+SCL 100 mg·kg-1組大鼠滑膜組織炎癥細胞明顯減少（P＜0.01），滑膜組織增生顯著減輕（P＜0.01），軟骨和骨侵蝕顯著減輕，OOCHAS評分顯著降低（P＜0.01）。

2.6 SCL對AA大鼠足跖關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥因子mRNA表達水平的影響

Fig.3 Effect of SCL on joint tissues of AA rats by HE staining.See Tab.2 for the rat treatment.Arrows show synovial hyperplasia，inflammatory cell infiltration，vasodilation，and cartilage destruction.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

與正常對照組相比，模型組COX-1，COX-2，TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-17mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，模型+SCL 25，50和100 mg·kg-1組及模型+Dex 0.25 mg·kg-1組COX-1mRNA表達均無顯著差異，模型+SCL 50 mg·kg-1組IL-1βmRNA表達顯著降低（P＜0.05），模型+SCL 100 mg·kg-1組IL-1β，COX-2，TNF-α和IL-6mRNA表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+Dex 0.25 mg·kg-1組TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-17和COX-2mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖4）。

2.7 SCL對AA大鼠足跖關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)基因mRNA表達水平的影響

與正常對照組相比，模型組AMPK，Beclin1，LC3-Ⅱ，ATG5，ATG7和ATG12mRNA表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），mTORmRNA表達明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+SCL 50和100 mg·kg-1組AMPK，Beclin1，LC3-Ⅱ，ATG5和ATG7mRNA表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；模型+SCL 100 mg·kg-1組mTORmRNA表達顯著降低（P＜0.05），模型+SCL 50和100 mg·kg-1組ATG12mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）（圖5）。

2.8 SCL對AA大鼠足跖關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白表達水平的影響

與正常對照組相比，模型組AMPK，Beclin1和ATG12蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），mTOR，LC3-Ⅱ，ATG5和ATG7蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，模型+SCL 100 mg·kg-1組AMPK，Beclin1，LC3-Ⅱ，ATG5和ATG7蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；模型+SCL 25，50和100 mg·kg-1組mTOR蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），ATG12蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）（圖6）。

Fig.4 Effect of SCL on mRNA expressions of TNF- α，IL-1 β，IL-6，IL-17，COX-1 and COX-2 in joint synovial tissue of AA model rats by RT-PCR.See Tab.2 for the rat treatment.B and D was the semi-quantatitive result of A and C，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05 ，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.5 Effect of SCL on mRNA expressions of AMPK，mTOR，Beclin1，LC3-Ⅱ，ATG5，ATG7 and ATG12 in joint synovium of AA model rats by RT-PCR.See Tab.2 for the rat treatment.B was the semi-quantatitive result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.6 Effect of SCL on protein expressions of AMPK，mTOR，Beclin1，LC3-Ⅱ，ATG5，ATG7 and ATG12 in joint synovium of AA model rats by Western blotting.See Tab.2 for the rat treatment.B was the semi-quantatitive result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05 ，##P＜0.01 ，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，SCL可明顯抑制AA大鼠足腫脹度；抑制AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織增生和炎癥細胞浸潤，同時還可減少軟骨損害，尤其是SCL 100 mg·kg-1組基本無炎癥浸潤現(xiàn)象。經(jīng)過SCL治療的AA大鼠致炎滑膜組織中TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-17和COX-2mRNA表達顯著降低。整體動物實驗中SCL對炎癥相關(guān)因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-17和COX-2mRNA表達也具有抑制作用。提示SCL可抑制AA大鼠炎癥反應(yīng)。

RA患者體內(nèi)由于糖酵解酶6磷酸果糖2激酶/果糖-2，6-二磷酸酶的不足使得T細胞糖酵解通量低和ATP缺乏［3，10］，使得AMP與ATP的比值下降，使得患者體內(nèi)細胞自噬相關(guān)AMPK-PI3K-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑激活，且使該途徑的基因和蛋白表達異常［12］。而AMPK-PI3K-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑中AMPK和mTOR是啟動細胞自噬通路的關(guān)鍵基因和蛋白。提示，RA患者體內(nèi)的細胞自噬途徑異常，可能成為RA發(fā)病的機制之一。

細胞自噬是通過降解細胞內(nèi)長壽命蛋白和破損的細胞器來發(fā)揮保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用［13］。巨自噬是自噬的主要形式，特別是依賴于自噬相關(guān)基因ATG調(diào)控的細胞生物學途徑。一般情況下，自噬小體形成于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的接觸點。2個泛素類共軛系統(tǒng)（ATG12和ATG8/LC3-Ⅱ）將雙膜自噬體延伸至胞質(zhì)的一部分，利用與溶酶體相遇并融合的微管軌跡。AMPK活化并促進unc-51樣激酶復合物的產(chǎn)生，并且阻滯mTOR生成，對細胞自噬產(chǎn)生促進作用。同時，unc-51樣激酶復合物促進Beclin1的生成，進而激活自噬小體的產(chǎn)生，進一步促進LC3-Ⅱ的生成，此過程中，ATG7作為類E1泛素活化酶激活A(yù)TG12；然后ATG12被傳遞給類E2泛素轉(zhuǎn)移酶，最后ATG12與ATG5結(jié)合形成復合物，促進自噬小體與溶酶體結(jié)合，使轉(zhuǎn)運的物質(zhì)與溶酶體結(jié)合，進而被細胞分解再利用［14］。ATG5，ATG7和ATG12存在一種級聯(lián)關(guān)系，可能在表達時存在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平并不完全一致的情況，本實驗結(jié)果中，正常對照組和模型組ATG5和ATG7 mRNA和蛋白表達結(jié)果存在差異，此差異可能是這種基因級聯(lián)表達在AA大鼠模型中的體現(xiàn)，王亞黎［15］和李曉燕等［16］等在構(gòu)建大鼠模型時也出現(xiàn)了相同的差異性。但這種差異性并不會影響基因的表達，這可能與自噬相關(guān)基因在AA大鼠模型中的合成和表達相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，SCL可以升高AMPK的表達水平，抑制自噬負調(diào)節(jié)蛋白mTOR的表達水平；同時也可使與AMPK級聯(lián)的Beclin1和LC3-Ⅱ的表達水平顯著升高。而調(diào)控自噬小體與溶酶體結(jié)合的ATG5，ATG7和ATG12表達水平也明顯升高。說明SCL對AA大鼠致炎滑膜組織細胞自噬起到促進作用。

綜上，SCL對CFA所致的AA大鼠的炎癥反應(yīng)具有治療作用，其機制可能與其促進AA大鼠致炎滑膜組織中細胞自噬水平相關(guān)，為深入研究SCL的抗炎作用及其機制提供了實驗依據(jù)。