齊秀春，陳 昕，曹玉凈，李 揚(yáng)，宋 鵬，王前進(jìn)，艾進(jìn)偉，李浩亮

（河南省中醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，河南 鄭州 450002）

創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎（post-traumatic osteoar?thritis，PTOA）是一種由關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后引起的繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA），可發(fā)于任何年齡組，以關(guān)節(jié)軟骨退化、關(guān)節(jié)疼痛及行動(dòng)功能障礙為主要特征。OA是運(yùn)動(dòng)相關(guān)致殘的主要影響因素，其發(fā)病率近年來逐漸增加，在美國(guó)造成了每年≥30億美元的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。PTOA與OA的病理進(jìn)程相似，均與炎癥免疫應(yīng)答相關(guān)。在PTOA進(jìn)程中，炎癥反應(yīng)可使關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的合成及降解代謝失衡，加重炎癥反應(yīng)，從而加快軟骨退變進(jìn)程［2］。因此，靶向調(diào)控炎癥應(yīng)答在OA及PTOA的防治中具有重要意義［3-4］。

西紅花酸（crocetin）是鳶尾科番紅花屬植物西紅花中的主要有效成分。研究表明，其具有抗氧化、抗凋亡及降血糖的功效，在心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用［5］。近期研究發(fā)現(xiàn)，西紅花酸具有潛在的抗腫瘤及抗炎作用［6］，通過抑制心肌細(xì)胞損傷及炎癥應(yīng)答減緩缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）誘導(dǎo)的心肌損傷［7］，還可抑制神經(jīng)損傷引發(fā)的神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激，從而減緩神經(jīng)性疼痛［8］。但西紅花酸在OA中的功效尚不清楚。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞分解代謝及炎癥應(yīng)答的影響，從而為OA的防治提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

西紅花酸（上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度≥98%）。DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；SYBR?Premix Ex Taq實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3、MMP-13和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA檢測(cè)試劑盒，兔抗人p-Akt多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人p-P65 NF-κB單克隆抗體、兔抗人P65 NF-κB多克隆抗體、兔抗人磷脂酰肌醇3激酶（phosphati?dylionsitol 3-kinase，PI3K）P85多克隆抗體、兔抗人p-PI3K P85單克隆抗體、小鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG（美國(guó)Abcam公司）；MTT試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）和二喹啉甲酸（bicin?choninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；逆轉(zhuǎn)錄一鏈cDNA合成試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（LS-C0150）（美國(guó)Thermo Fisher公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：iMark）（美國(guó)Bio Tek公司）；垂直電泳儀（型號(hào)：JY300HC）、轉(zhuǎn)移芯（型號(hào)：JY-ZY6）（北京君意公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像一體機(jī)（型號(hào)：WSE-5200）（日本ATTO公司）。

1.2 細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)和分組

Lonza人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞NHAC-kn（Catalog#：CC-2550，北京澤平科技有限責(zé)任公司）培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、IL-1β組、IL-1β+西紅花酸0.5，1，5，10和20 μmol·L-1組；西紅花酸處理12 h后，再加IL-1β 10 μg·L-1處理24 h。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率

將細(xì)胞按1×109L-1密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別用西紅花酸 0.5，1，5，10，20，50，100，200，400，800和1000 μmol·L-1處理細(xì)胞12 h；加MTT（5 g·L-1）10 μL，繼續(xù)孵育 4 h；每孔加二甲亞砜100 μL，混勻后37℃孵育3 h以溶解紫色結(jié)晶；酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度（A490nm）值，每孔重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=處理組A490nm值/細(xì)胞對(duì)照組A490nm值×100%。采用Graphpad Prism8軟件計(jì)算IC50值。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原、MMP-3和MMP-13 mRNA表達(dá)水平

收集1.2處理組細(xì)胞，用TRIzol試劑抽提細(xì)胞總RNA；采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系如下：ROX reference dyeⅡ0.4 μL、特異性擴(kuò)增引物0.8 μL、SYBR? Premix EX TaqTMⅡ10 μL，加ddH2O補(bǔ)充至20 μL。具體步驟按SYBR?Premix Ex Taq實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，特異性PCR擴(kuò)增引物序列如下：Ⅱ型膠原（上游5’-GAACCCAGAAACAACACAATCC-3’；下游 5’-CATTCAGTGCAGAGTCCTAGAG-3’），MMP-3（上游5’-GTGAGGACACCAGCATGAA-3’；下游5’-GACCACTGTCCTTTCTCCTAAC-3’），MMP-13（上游5’-AGCATCTGGAGTAACCGTATTG-3’；下游5’-CCC-GCACTTCTGGAAGTATT-3’），所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。設(shè)置β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，2-△△Ct法檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄。

1.5 ELISA檢測(cè)人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-3，MMP-13，PGE2，IL-6和TNF- α蛋白表達(dá)水平

收集1.2處理組細(xì)胞，加入96孔板中，PBS洗滌后，參照ELISA試劑盒操作說明書分別加MMP-3，MMP-13，IL-6或TNF-α一抗，37℃孵育1 h；PBS洗滌，加HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗繼續(xù)孵育，隨后加TMB顯色液避光孵育，最后加終止液。酶標(biāo)儀檢測(cè)A450nm值。其中，PGE2 ELISA試劑盒中使用的是堿性磷酸酶（AP）偶聯(lián)的抗PGE2抗體，顯色底物為pNpp，酶標(biāo)儀檢測(cè)A450nm值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.6 試劑盒法測(cè)定人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中NO含量

收集1.2處理組細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后離心收集上清；取上清50 μL置96孔培養(yǎng)板中，加相同體積的室溫Griess試劑Ⅰ和Ⅱ，酶標(biāo)儀檢測(cè)A540nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量。

1.7 Western印跡法檢測(cè)人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中PI3K P85，p-PI3K P85，Akt，p-Akt，P65 NF- κB和p-P65 NF- κB蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、IL-1β組、IL-1β+西紅花酸10 μmol·L-1組，按照1.2處理。用RIPA裂解液抽提各組總蛋白，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；取等量的蛋白樣本加入SDS上樣緩沖液，沸水處理10 min；將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將膜置于含5%脫脂奶的TBST中封閉2 h，加入p-Akt（1∶1500）、Akt（1∶1000）、p-P65 NF-κB（1∶1000）、P65 NF-κB（1∶2000）、PI3K P85（1∶1000）、p-PI3K P85（1∶1000）和β肌動(dòng)蛋白（1∶3000）一抗，4℃孵育過夜；TBST洗滌3次后加相應(yīng)的二抗（1∶5000）；加ECL顯色，Image J軟件測(cè)定條帶積分吸光度值，以目的蛋白與β肌動(dòng)蛋白積分吸光度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 西紅花酸對(duì)人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，西紅花酸0.5～20 μmol·L-1處理后人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞的存活率無顯著變化，表明低濃度西紅花酸對(duì)人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞無毒性，其IC50值為131.8 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of crocetin on viability of human chon?drocytes of knee joints detected by MTT assay.Human chondrocytes of knee joints were pretreated with crocetin 0.5，1，5，10，20，50，100，200，400，800 or 1000 μmol·L-1for 12 h.±s，n=3.

2.2 西紅花酸對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-13和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，IL-1β組MMP-3和MMP-13mRNA水平顯著升高（P＜0.05），Ⅱ型膠原mRNA水平顯著降低（P＜0.05）；與IL-1β組相比，IL-1β+西紅 花 酸 5～20 μmol· L-1組MMP-3和MMP-13mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，表1），IL-1β+西紅花酸10～20 μmol·L-1組Ⅱ型膠原mRNA水平顯著升高（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Effect of crocetin on mRNA levels of matrix metalloproteinase（MMP）-3，MMP-13 and collagen Ⅱin human chondrocytes of knee joints induced by inter?leukin 1 β（IL-1 β）detected by qRT-PCR

2.3 西紅花酸對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞MMP-3，MMP-13，PGE2，IL-6和TNF- α蛋白表達(dá)水平的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，IL-1β組MMP-3，MMP-13，PGE2，IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組相比，IL-1β+西紅花酸5～20 μmol·L-1組MMP-3，MMP-13和PGE2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），IL-1β+西紅花酸10～20μmol·L-1組IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，表2）。

Tab.2 Effect of crocetin on protein levels of MMP-3，MMP-13，prostaglandin E2（PGE2），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor- α（TNF- α）in human chondrocytes of knee joints induced by IL-1 β detected by ELISA

2.4 西紅花酸對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞NO含量的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，IL-1β組人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中NO含量顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組相比，IL-1β+西紅花酸5～20 μmol·L-1組NO含量顯著降低（P＜0.05，表3）。

2.5 西紅花酸對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中PI3K P85，p-PI3K P85，Akt，p-Akt，P65 NF- κB和p-P65 NF- κB蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，IL-1β組p-Akt，p-P65 NF-κB，PI3K P85和P-PI3K P85蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與IL-1β組相比，IL-1β+西紅花酸10 μmol·L-1組p-Akt，p-P65 NF-κB和p-PI3K P85蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。IL-1β組和IL-1β+西紅花酸10 μmol·L-1組Akt和P65 NF-κB蛋白表達(dá)水平無顯著變化。

Tab.3 Effect of crocetin on production of nitric oxide（NO）in human chondrocytes of knee joints induced by IL-1 β

Fig.2 Effect of crocetin on protein expressions of phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）P85，p-PI3K P85，Akt，p-Akt，P65 NF- κB and p-P65 NF- κB in human chon?drocytes of knee joints induced by IL-1 β detected by Western blotting.Chondrocytes were pretreated with crocetin 10 μmol·L-1for 12 h.Then chondrocytes were treated with IL-1β 10 μg·L-1for 24 h.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with IL-1β group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，西紅花酸可抑制IL-1β誘導(dǎo)的人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞MMP-3和MMP-13生成，并減弱IL-1β對(duì)Ⅱ型膠原的抑制效應(yīng)。該結(jié)果提示，西紅花酸可能通過抑制IL-1β誘導(dǎo)的過度分解代謝減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。MMP是軟骨基質(zhì)降解的重要參與者，可直接降解Ⅱ型膠原及蛋白聚糖，在維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。Ⅱ型膠原是軟骨組織中的重要膠原蛋白，是維持軟骨組織結(jié)構(gòu)及維持功能的基礎(chǔ)。AKHTAR等［10］發(fā)現(xiàn)，抑制MMP的產(chǎn)生有利于減緩PTOA動(dòng)物模型中軟骨的降解進(jìn)程。胡慧等［11］研究表明，西紅花酸可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的膠原合成，從而起到抗心肌纖維化作用，其機(jī)制可能與細(xì)胞因子分泌和對(duì)MMP的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，西紅花酸顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。關(guān)節(jié)損傷后會(huì)誘導(dǎo)大量炎癥因子如IL-1β，IL-6和TNF-α等釋放，可促使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)降解，從而啟動(dòng)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中軟骨退變及損傷［2］。

本研究結(jié)果顯示，西紅花酸顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的NO和PGE2產(chǎn)生。NO可由一氧化氮合酶合成，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞釋放MMP和PGE2，加速軟骨基質(zhì)的崩解及炎癥反應(yīng)，抑制膠原和蛋白多糖的合成，從而最終加重骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中的軟骨損傷及退化［12］。PGE2是骨關(guān)節(jié)炎炎癥應(yīng)答中的重要參與者，由環(huán)氧化酶2產(chǎn)生，可通過調(diào)節(jié)MMP和炎癥因子的產(chǎn)生加重骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中軟骨基質(zhì)的降解［13］。以往研究也發(fā)現(xiàn)，靶向一氧化氮合酶及環(huán)氧化酶2具有潛在的抗骨關(guān)節(jié)炎的功效［12-13］，而西紅花酸可抑制出血性休克中一氧化氮合酶的產(chǎn)生［14］。西紅花酸還可抑制巨噬細(xì)胞中PGE2和NO的產(chǎn)生，其機(jī)制可能與核因子E2相關(guān)因子2有關(guān)［15］。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β處理顯著增加人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中p-PI3K P85，p-Akt和p-p65 NF-κB的表達(dá)水平，而西紅花酸則能顯著抑制p-PI3K P85，p-Akt和p-P65 NF-κB的表達(dá)。PI3K是PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，當(dāng)細(xì)胞接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)后，PI3K發(fā)生活化，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2的輔助下，分別使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser473）磷酸化激活。NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，PI3K/Akt是調(diào)節(jié)NF-κB及其下游基因表達(dá)的重要信號(hào)分子。本研究結(jié)果提示，PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路的抑制可能參與了西紅花酸對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝和炎癥應(yīng)答的調(diào)控。PI3K/Akt/NF-κB是重要的炎癥調(diào)控通路，在包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種炎癥相關(guān)疾病中過度活化。以往研究證實(shí)，阻斷IL-1β誘導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB的活化可抑制人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放，同時(shí)降低MMP的產(chǎn)生，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中軟骨的降解［16］。

綜上所述，西紅花酸可抑制IL-1β誘導(dǎo)的人膝關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞分解代謝進(jìn)程及炎癥應(yīng)答，PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路參與其中。本研究將為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供新的治療策略。