劉 玲，曹夢瑤，陳晶晶，徐靜蕾，黃紫樂

（河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽 471003）

原發(fā)性肝癌的發(fā)生是由多條信號通路和多個基因共同參與控制的復(fù)雜過程，其病情發(fā)展較快，起病隱匿，惡性程度高。二乙基亞硝胺（diethylni?trosamine，DEN）是一種強(qiáng)致癌物，在化妝品、食品、香煙等中都含有亞硝胺類化合物。高濃度一氧化氮（nitric oxide，NO）作為一種信號分子能調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生過程，包括血管生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。但NO在水中溶解度有限，半衰期較短，而NO可與其他分子偶聯(lián)形成新的NO型供體化合物。因此，NO供體是穩(wěn)定釋放NO的有效途徑，其中偶氮鎓二醇鹽在靶向釋放NO作用方面較為明顯，O2（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧羰基）哌嗪-1-yl〕偶氮-1-鎓-1，2-二醇（JS-K）可與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）結(jié)合，在GST作用下釋放高濃度NO［2］。JS-K也可顯著抑制肝細(xì)胞癌的增殖，引起Jun激酶（jun kinase，JNK）和P38及其下游效應(yīng)物c-Jun和激活蛋白（activator protein-1，AP-1）的活化［3］。前期研究表明，JS-K可減少大鼠肝癌瘤塊形成，上調(diào)蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）蛋白表達(dá)，下調(diào)β連環(huán)蛋白（β-catenin）、c-Myc和p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達(dá)；增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）和Ca2+水平，經(jīng)胱天蛋白酶依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4-5］。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregluated kinase，ERK）通路是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，在許多腫瘤（如肝癌、黑色素瘤和乳腺癌等）中都可發(fā)現(xiàn)ERK過度激活，而有關(guān)JS-K對ERK通路中的具體作用機(jī)制尚未見報道，本研究以DEN為誘導(dǎo)劑建立大鼠原發(fā)性肝癌模型，通過檢測肝組織中促細(xì)胞絲裂原細(xì)胞外激酶（mito?gen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探索外源性NO對肝癌中MEK/ERK信號通路的影響及其作用機(jī)制，為NO供體抗腫瘤機(jī)制研究提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

健康雄性Wistar大鼠40只，約6周齡、體質(zhì)量180～220 g，購自河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0007。將大鼠飼養(yǎng)在室溫22～28℃、自然光、相對濕度為40%～60%、通風(fēng)良好的環(huán)境中，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

JS-K購自美國Santa公司；DEN購自美國Sigma公司；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、羥脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、AFP異質(zhì)體 3（alpha-fetoprotein variants，AFP-L3）和異常凝血酶原（abnormal prothrombin，APT）ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗大鼠p-MEK（cat#9121）、核糖體 S6蛋白激酶 P90（phospho-P90 ribosomal S6 kinase，p-P90RSK）（cat#9341）多克隆抗體和兔抗大鼠p-ERK（cat#4376）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Tech?nology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（SA00001-2）購自武漢三鷹公司；通用SP檢測試劑盒（SP0041）購自北京索萊寶公司。其他試劑均為分析純。

電泳儀DYCZ-40D購自北京六一科技有限公司；BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：Universal HoodⅡ）購自美國伯樂公司。

1.2 動物分組和給藥

40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)均分為正常對照組（ip，生理鹽水10 mL·kg-1）、模型組（ip，DEN 50 mg·kg-1），前4周每周2次，4周后每周1次，連續(xù)16周；JS-K 0.25和0.5 mg·kg-1藥物組尾靜脈注射，每周2次，在DEN注射后1 d給藥，連續(xù)16周。造模過程觀察記錄各組大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量和生存狀態(tài)。16周后摘眼球取血，離心取血清；取肝組織，觀察肝的色澤、質(zhì)地、大小，表面有無結(jié)節(jié)形成等。剪取部分組織，用0.9%生理鹽水沖洗，一部分用4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片進(jìn)行HE染色和免疫組化實驗等；一部分用于制備組織勻漿提取蛋白進(jìn)行Western印跡實驗。通過HE染色檢測肝組織病理變化，EILSA試劑盒檢測血清中腫瘤標(biāo)志物AFP，AFP-L3和APT含量作為模型建立成功的依據(jù)［6-7］。

1.3 抑瘤作用評價

計數(shù)各組大鼠肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)；剝離大鼠肝腫瘤組織并稱重，計算各組抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質(zhì)量-藥物組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.4 比色法檢測血清 γ-GT和AKP活性及羥脯氨酸含量

按γ-GT試劑盒操作要求，在測定管和對照管都加入0.1 mL血清樣品，測定管中加入2 mL底物基質(zhì)液，混勻，37℃水浴10 min，之后在測定管和對照管中加入0.2 mL終止劑，在對照管中加入2 mL基質(zhì)液，混勻，在正常條件下放置5 min，用蒸餾水調(diào)零，在410 nm測各管吸光度（A410nm），根據(jù)公式計算γ-GT活性。血清γ-GT活性=〔（樣本A410nm-對照A410nm）×232.56〕。

按AKP試劑盒（微板法）操作要求，在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔各加5 μL雙蒸水、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、待測血清，然后在各孔均加50 μL緩沖液和50 μL基質(zhì)液，混勻，在37℃水浴15 min。各孔中加顯色劑，測定A520nm值，根據(jù)公式計算AKP活性。血清中AKP活性=〔（樣本A520nm-空白A520nm）/（標(biāo)準(zhǔn)A520nm-空白A520nm）〕×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×100 mL×樣本稀釋倍數(shù)。

按羥脯氨酸試劑盒操作要求，取0.5 mL血清加水解液1 mL，混勻，沸水浴中水解20 min，流水冷卻后調(diào)pH值至6.0～6.8。按說明書操作步驟，加檢測試劑后60℃水浴15 min，冷卻后離心10 min，取上清測各管A520nm值，根據(jù)公式計算羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量=〔（樣本A550nm-空白A550nm）/（標(biāo)準(zhǔn)A550nm-空白A550nm）〕×標(biāo)準(zhǔn)品含量×水解液總體積/取樣量。

1.5 HE染色檢測肝組織病理變化

將肝組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片、烤片、脫蠟，經(jīng)梯度乙醇水化、HE染色后，脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.6 ELISA檢測血清AFP，AFP-L3和APT含量

按AFP，AFP-L3和APT檢測ELISA試劑盒操作要求，將血清樣品加入相應(yīng)酶標(biāo)板，分別設(shè)空白對照孔，同時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的加樣。加相應(yīng)酶試劑，溫育1 h，加滿洗滌液靜置30 s后棄去，重復(fù)5次。然后加顯色劑，15 min后終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測定A450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算AFP，AFP-L3和APT在血清中的含量。

1.7 Gomori銀染法檢測肝組織網(wǎng)狀纖維水平

石蠟切片脫蠟后，加入高錳酸鉀氧化、草酸漂白、硫酸鐵銨媒染、Gomori銀氨液染色、中性甲醛液還原后，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的網(wǎng)狀纖維變化，采用Image-Pro Plus 6.0軟件（美國MediaCybemetics公司）對網(wǎng)狀纖維的陽性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行吸光度值統(tǒng)計分析，各組與正常對照組的平均光吸光值的比值表示網(wǎng)狀纖維變化水平。

1.8 免疫組化法檢測肝組織中p-ERK表達(dá)水平

將制備的石蠟切片在二甲苯中脫蠟，濃度梯度乙醇脫水，3%H2O2作用20 min淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，浸入95°C檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 6.0）20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，加山羊血清37℃封閉1 h，PBS洗滌2次，每次3 min，加p-ERK（1∶200）4℃過夜，PBS清洗，滴加鏈酶親和素-POD工作液，PBS清洗，DAB顯色。蒸餾水清洗，終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核5 min，自來水水洗返藍(lán)，中性樹膠封片后，顯微鏡下拍照，棕黃色或褐色顆粒視為陽性表達(dá)區(qū)域。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對陽性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行積分吸光度值半定量分析，各組與正常對照組的平均積分吸光度值的比值表示p-ERK蛋白水平。

1.9 Western印跡法檢測肝組織中p-ERK，p-MEK和p-P90RSK蛋白表達(dá)水平

取部分肝組織勻漿置于離心管中，加裂解液裂解提取總蛋白，BCA法測定總蛋白含量。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加相應(yīng)一抗（稀釋倍數(shù)均為1∶1000）4℃孵育過夜；二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，并對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。應(yīng)用Chemis?cope Analysis圖像分析軟件對條帶進(jìn)行積分吸光度值分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白（β肌動蛋白）的積分吸光度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 JS-K對大鼠腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響

DEN處理16周后，與正常對照組相比，模型組大鼠肝硬度增加，表面呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀，并出現(xiàn)單發(fā)或多發(fā)的大小不等的肝癌結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)數(shù)和瘤質(zhì)量結(jié)果（表1）顯示，與模型組相比，JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和腫瘤質(zhì)量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）對肝腫瘤的抑瘤率增加，提示JS-K可抑制大鼠原發(fā)性肝癌的發(fā)生。

Tab.1 Effect of JS-K on tumor nodule number，tumor mass and tumor inhibitory rate in diethylnitrosomine（DEN）-treated rats

Fig.1 Effect of JS-K on activities of γ-glutamyl transferring（ γ-GT，A），alkaline phosphatase（AKP，B）and content of hydroxyproline（C）in serum of DEN-treated rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 JS-K對大鼠血清中 γ-GT和AKP活性及羥脯氨酸含量的影響

比色法結(jié)果（圖1）顯示，在DEN處理16周后，與正常對照組相比，模型組γ-GT和AKP活性及羥脯氨酸含量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組γ-GT和AKP活性及羥脯氨酸含量顯著降低（P＜0.01），提示JS-K可減輕肝損傷和纖維化程度。

2.3 JS-K對大鼠肝組織病理變化的影響

HE結(jié)果（圖2）顯示，在DEN處理16周后，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，可見多發(fā)大小不等、形狀各異的癌巢，癌巢周圍可見較多毛細(xì)血管，肝細(xì)胞變性壞死，出現(xiàn)多核、核固縮、核內(nèi)空泡等現(xiàn)象，提示模型建立成功［6］。JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組肝小葉結(jié)構(gòu)相對完好，癌細(xì)胞分化程度高，提示JS-K減輕了DEN誘導(dǎo)性肝癌的發(fā)生。

2.4 JS-K對大鼠血清中AFP，AFP-L3和APT含量的影響

ELISA結(jié)果（圖3）顯示，在DEN處理16周后，與正常對照組相比，模型組AFP，AFP-L3和APT含量均明顯升高（P＜0.01），提示模型建立成功。與模型組相比，JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組以上指標(biāo)均降低（P＜0.05，P＜0.01），提示JS-K可減輕DEN誘發(fā)性大鼠肝癌的惡性程度。

2.5 JS-K對大鼠肝組織中網(wǎng)狀纖維水平的影響

Gomori染色結(jié)果（圖4）顯示，在DEN處理16周后，模型組大鼠肝組織網(wǎng)狀纖維失去正常分布狀態(tài)，自匯管區(qū)周圍網(wǎng)狀纖維塌陷、融合、增粗、包裹并已形成假小葉。JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組大鼠肝組織網(wǎng)狀纖維化程度陽性表達(dá)區(qū)域明顯減少（446±37，301±51vs598±74，P＜0.01）提示JS-K可減輕DEN誘發(fā)性大鼠肝癌的纖維化程度。

Fig.2 Effect of JS-K on morphological changes in liver tissue of diethylnitrosomine（DEN）-treated rats.See Fig.1 for the rat treatment.The arrows show areas of disordered arrangement in the hepatic cells.

Fig.3 Effect of JS-K on content of α-fetoprotein（AFP，A）， α-fetoprotein variants（AFP-L3，B）and abnormal pro?thrombin（APT，C）in serum of DEN treated rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.4 Effect of JS-K on reticular fiber of liver tissue of DEN-treated rats by Gomori staining.See Tab.1 for the rat treatment.The arrows show the reticular fibers.

2.6 JS-K對大鼠肝組織中p-ERK表達(dá)水平的影響

免疫組化結(jié)果（圖5）顯示，與正常對照組相比，在DEN處理16周后，模型組大鼠肝組織p-ERK表達(dá)升高。與模型組相比，JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組p-ERK表達(dá)降低（119±10，70±16vs164±21，P＜0.01），提示JS-K可減輕DEN誘發(fā)性大鼠肝癌中p-ERK蛋白的表達(dá)。

Fig.5 Effect of JS-K on levels of p-ERK in liver tissue of DEN-treated rats.See Tab.1 for the rat treatment.The arrows show p-ERK-positive staining.

2.7 JS-K對肝組織中MEK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.6 Effect of JS-K on phosphorylation of MEK/ERK pathways and apoptotic related proteins in liver tissue of DEN-treated rats.See Tab.1 for the rat treatment.B was semi-quantitative result of A.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01 compared with model group.

Western印跡結(jié)果（圖6）顯示，在DEN處理16周后，與正常對照組相比，模型組中MEK，ERK和P90RSK蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，JS-K 0.25和0.50 mg·kg-1組MEK/ERK通路相關(guān)蛋白MEK，ERK和P90RSK蛋白磷酸化顯著降低（P＜0.01），提示JS-K可抑制MEK/ERK通路的激活。

3 討論

本研究通過檢測大鼠血清中酶活性，羥脯氨酸含量、肝病理改變、腫瘤標(biāo)志物和肝纖維化程度，以確定偶氮鎓二醇鹽衍生物在大鼠DEN誘發(fā)性肝癌模型中的作用。結(jié)果顯示，JS-K顯著降低大鼠血清中γ-GT和AKP活性及羥脯氨酸含量；也可降低AFP，AFP-L3和APT的含量，改善肝纖維化程度，使p-ERK在組織中表達(dá)減少，以及p-MEK和p-P90RSK表達(dá)水平下降，提示JS-K對大鼠原發(fā)性肝癌所致的肝損傷和纖維化的抑制作用，與其抑制MEK/ERK信號通路有關(guān)。

JS-K在GST作用下可釋放NO。肝組織中γ-GT主要局限于毛細(xì)膽管和肝細(xì)胞的微粒體中，可用于對占位性肝病，肝實質(zhì)損傷（慢性肝炎和肝硬化）的診斷等；在膽管梗阻、肝細(xì)胞損害、膽管上皮再生和癌變等情況下，肝細(xì)胞過度產(chǎn)生AKP，經(jīng)淋巴道和肝竇返流入血液［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，JS-K可減少γ-GT和AKP活性，減輕在DEN誘發(fā)性肝癌中所致的肝損傷。研究表明，肝細(xì)胞癌通常由慢性肝炎進(jìn)展為肝纖維化，再由肝癌纖維化進(jìn)展為肝硬化，最終演變成肝細(xì)胞癌，其中羥脯氨酸是合成膠原的重要氨基酸，其含量決定膠原蛋白的數(shù)量，可反映肝纖維化程度［9］。本研究中，JS-K可減少羥脯氨酸含量，進(jìn)而抑制大鼠原發(fā)性肝癌纖維化進(jìn)程。在大鼠原發(fā)性肝癌模型建立過程中，本研究通過檢測大鼠血清中AFP，AFP-L3和APT 3項指標(biāo)，對原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷和藥物作用后的評估。AFP是原發(fā)性肝癌的最靈敏和特異的腫瘤標(biāo)志；在肝癌發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞可特異性產(chǎn)生AFP-L3，而且具有早期血管浸潤和轉(zhuǎn)移趨勢的特性，且AFP-L3的含量與腫瘤的惡化程度成正比；APT是一種維生素K缺乏誘導(dǎo)蛋白，肝癌組織可產(chǎn)生大量APT釋放入血，隨著病程進(jìn)展，血清中APT含量隨之升高［7，10］。本研究結(jié)果顯示，在DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性大鼠模型中，大鼠血清中AFP，AFP-L3和APT含量均呈現(xiàn)顯著升高，結(jié)合肝組織病理變化結(jié)果，提示大鼠原發(fā)性肝癌模型建立成功。而JS-K給藥組可不同程度減少三者的含量，提示JS-K對大鼠原發(fā)性肝癌具有一定的抑制作用。網(wǎng)狀纖維主要由Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，在肝受到各種刺激因子損害時肝星形細(xì)胞被激活，使其異常蓄積而形成肝纖維化。JS-K在減少羥脯氨酸含量的同時也減少了網(wǎng)狀纖維的形成，提示JS-K可減輕DEN誘發(fā)性大鼠肝癌的纖維化程度，對原發(fā)性肝癌發(fā)展過程中纖維化的形成具有一定的抑制作用。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated pro?tein kinase，MAPK）是一組能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。研究表明，JS-K可抑制Hep3B肝癌細(xì)胞的增殖，這與JNK和P38及其下游效應(yīng)c-Jun和AP-1的激活有關(guān)，而NO清除劑可取消JS-K對MAPK的激活和腫瘤抑制作用［12］。ERK包括ERK1和ERK2，是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵激酶。MEK屬于雙重特異性激酶，使Tyr和Thr 2個調(diào)節(jié)位點(diǎn)磷酸化而激活ERK［12］。在生理狀態(tài)下，ERK是MEK的唯一下游底物，表明MEK及ERK在該通路中具有重要地位，激活后的ERK可通過磷酸化作用激活P90RSK及其底物，并與之共同入核促進(jìn)環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白等重要轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而調(diào)節(jié)如c-Fos，c-Myc，c-Jun等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中MEK/ERK通路關(guān)鍵性蛋白表達(dá)增加，JS-K可不同程度地降低MEK磷酸化水平，抑制其調(diào)控細(xì)胞生長和分化的作用，使ERK1/2（P44/42）磷酸化水平減少，抑制ERK易位至細(xì)胞核，從而減弱其對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。同時，JS-K可降低P90RSK的磷酸化水平，減弱其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。有研究報道，ERK信號通路在肝細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解中起到重要作用，阻斷ERK通路可抑制肝纖維化［15-16］。本研究結(jié)果顯示，JS-K可減少DEN誘發(fā)大鼠肝網(wǎng)狀纖維的水平，減輕纖維化病變程度，提示與其下調(diào)MAPK/ERK信號通路有關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，在DEN誘發(fā)性大鼠肝癌模型中，JS-K可降低ERK下游底物c-Myc蛋白的表達(dá)，與本次研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗證了JS-K對大鼠肝癌的抑制作用與其干預(yù)MEK/ERK信號通路有關(guān)。

綜上所述，偶氮鎓二醇鹽衍生物JS-K對大鼠原發(fā)性肝癌具有一定的抑制作用，可降低血清中AFP等腫瘤標(biāo)志物水平，減輕肝損傷和肝纖維化程度，與其抑制MEK/ERK通路有關(guān)。