何 權(quán)，劉丹瑜，葉 君，張艷麗，朱華棟，蔣澄宇*，徐 軍*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 急診科，北京 100730；3.北京大學(xué)第一醫(yī)院呼吸和危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100034)

肺炎(pneumonia)是一種由多種病原體引起的下呼吸道感染性疾病[1]。根據(jù)患病環(huán)境可以將肺炎分為社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)和醫(yī)院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia,HAP)等[2]。其中，CAP是一種常見的肺炎類型，是發(fā)達國家常見的因感染致死的疾病之一[3]。CAP是指在醫(yī)院外罹患的感染性肺實質(zhì)(含肺泡壁，即廣義上的肺間質(zhì))炎性反應(yīng)，包括具有明確潛伏期的病原體感染在入院后于潛伏期內(nèi)發(fā)病的肺炎。在過去的幾十年中，肺炎的診療策略已經(jīng)得到了顯著的改善，但CAP的發(fā)病率和病死率仍處于很高的水平，尤其是重癥社區(qū)獲得性肺炎(severe community-acquired pneumonia,SCAP)。臨床數(shù)據(jù)顯示，CAP的總體病死率為13%，但SCAP的病死率高達35%以上[4]。

SCAP的病死率與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)。國際指南建議使用不同的臨床評分標(biāo)準(zhǔn)對CAP的嚴(yán)重程度進行分級，目前常用的包括肺炎嚴(yán)重指數(shù)(pneumonia severity index,PSI)評分、CURB-65評分以及CRB-65(C:意識障礙，U:尿素氮，R:呼吸頻率，B:血壓，65:年齡)評分等[5]。但這些臨床評分標(biāo)準(zhǔn)的檢測指標(biāo)較多，且在非典型的臨床病例中也具有一定的局限性。因此，利用生物標(biāo)志物對預(yù)后情況進行預(yù)測引起了廣大科研工作者的關(guān)注。在生物樣本的檢測中，代謝組學(xué)可以特異性識別低分子量的內(nèi)源性代謝物并發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物[6-7]。本研究擬通過代謝組學(xué)的分析方法，探尋能夠預(yù)測SCAP預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)收集并篩選2015年1月至2019年6月北京協(xié)和醫(yī)院急診重癥監(jiān)護病房的68例SCAP患者以及30名健康志愿者，收集血液樣本。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批文號：S500)并獲得受試者簽署的知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：入住北京協(xié)和醫(yī)院急診重癥監(jiān)護病房并診斷為CAP的患者；符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會SCAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院24 h內(nèi)未采集血樣；拒絕簽署知情同意書；發(fā)病時間>10 d。

1.1.2 試劑:甲醇、甲酸和乙腈(CNW公司);L-2-氯苯丙氨酸(上海恒創(chuàng)生物科技有限公司);LysoPC17:0(Avanti公司)。

1.2 方法

1.2.1 臨床血液樣本前處理:收集68例成人SCAP患者和30名成人健康志愿者的外周血液樣本于抗凝離心管中。將血液樣本以4 ℃、3 000 r/min的條件離心15 min。離心完成后將上層血漿樣本收集并置于-80 ℃保存。

1.2.2 代謝組學(xué)的分析:色譜條件：采用ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)進行色譜分離，色譜柱的柱溫為45 ℃，流速為0.4 mL/min。A流動相為水(含0.1%甲酸)，B流動相為乙腈/甲醇(2/3)(v/v)(含0.1%甲酸)。進樣體積為1 μL。洗脫梯度見表1。

表1 液相色譜洗脫梯度Table 1 Liquid chromatography elution gradient

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI v2.3 軟件(Nonlinear Dynamics,Newcastle,UK)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化。

2 結(jié)果

2.1 健康對照與SCAP患者一般資料

健康對照與SCAP患者在性別及年齡上差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 健康對照與SCAP患者之間的差異代謝物

多元統(tǒng)計分析OPLS-DA得分圖顯示健康對照和SCAP患者具有顯著的組間差異，組內(nèi)差異較小(圖1A)，且OPLS-DA模型具有穩(wěn)定性和可靠性(圖1B)。根據(jù)OPLS-DA模型得到VIP值，根據(jù)VIP>1的條件篩選得到224個差異代謝物。根據(jù)P值和FC(P<0.05,FC>2或者FC<0.5)進行差異篩選，得到1 316個差異代謝物(圖2)。進一步結(jié)合單變量統(tǒng)計分析和多元統(tǒng)計分析，最終得到健康對照和SCAP患者之間的差異代謝物共126個。

2.3 5-羥色胺可以預(yù)測SCAP患者的預(yù)后

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平在SCAP預(yù)后存活組與死亡組間存在顯著差異(圖3A)，可以預(yù)測SCAP患者預(yù)后情況(圖3B)。5-HT水平越低，SCAP患者最終死亡的可能性越大，且與患者的性別和年齡無關(guān)(表2)。

2.4 5-羥色胺與氧合指數(shù)呈正相關(guān)，與急性生理與慢性健康評分 II負(fù)相關(guān)

在SCAP患者中，存活組的氧合指數(shù)(oxygenation index,OI)高于死亡組，急性生理與慢性健康評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)低于死亡組(表3)。此外，5-HT與OI呈正相關(guān)，與APACHE Ⅱ評分水平呈負(fù)相關(guān)，與SCAP患者的臨床指標(biāo)具有相關(guān)性(圖4)。

A.OPLS-DA score plots for healthy and SCAP patients(R2X=0.653,R2Y=969,Q2=0.886);B.validation plots obtained from 999 permutation for healthy and SCAP patients;the stability and credibility were supported by the result that all permuted R2 and Q2 values on the left were lower than the original point on the right,and that the Q2 regression line in blue had a negative intercept圖1 代謝譜分析結(jié)果的OPLS-DA得分圖和響應(yīng)排序檢驗圖Fig 1 OPLS-DA score plots and validation plots for metabolic profiling results

The green dots represented FC<0.5 and P value <0.05 between healthy and SCAP;The red dots represented FC>2 and P value <0.05 between healthy and SCAP;The gray dots represented no significant difference between healthy and SCAP圖2 健康對照和SCAP患者的火山圖Fig 2 Volcanic map in healthy and SCAP groups

3 討論

5-羥色胺(serotonin,5-hydroxytryptamine,5-HT)，又名血清素，是一種神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)的多種生物學(xué)過程[8]。除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外，5-HT在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮了重要作用。多種免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，均具有合成、儲存和轉(zhuǎn)運5-HT的能力[9]。但機體內(nèi)有將近95%的5-HT都是由腸粘膜中的腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cell,EC)合成的[10]。研究表明，5-HT參與腸道色氨酸代謝的關(guān)鍵途徑，在炎性腸病中具有重要調(diào)節(jié)作用[11]。

本研究結(jié)果顯示健康對照的5-HT水平高于SCAP患者組，并且SCAP患者的5-HT水平在存活與死亡組中存在顯著性差異。死亡組的5-HT水平顯著低于存活組，提示5-HT水平越低，SCAP患者的預(yù)后情況可能越差。OI是反映細(xì)胞外供氧水平的指標(biāo)，可以反映組織的供氧量和氧氣需求量。OI也是危重患者預(yù)后的重要預(yù)測指標(biāo)，動態(tài)監(jiān)測OI可以有效指導(dǎo)治療方案并評估預(yù)后[12-13]。APACHE Ⅱ評分常用于評估ICU患者病情的嚴(yán)重程度，臨床上一般以初入ICU的24 h內(nèi)的評分作為初步判斷。APACHE Ⅱ評分越高，患者的預(yù)后越差[14]。本研究發(fā)現(xiàn)5-HT水平與OI正相關(guān)，與APACHE Ⅱ評分負(fù)相關(guān)。此外，存活組的OI水平高于死亡組，而APACHE Ⅱ評分低于死亡組。這進一步說明5-HT的水平可以反映SCAP患者的預(yù)后情況，有望成為預(yù)測SCAP預(yù)后的生物標(biāo)志物，對SCAP患者的臨床治療和預(yù)后評估具有重要指導(dǎo)意義。

A.boxplots of 5-HT level of healthy (n=30),survive patients (n=49) and non-survive patients (n=19),*P<0.001,Kruskal Wallis test;B.receiver operating characteristic curve(ROC) of 5-HT level according to prognosis (survive or non-survive),AUC=0.762,P<0.05 was considered as significant differences圖3 健康對照和不同預(yù)后SCAP患者的5-羥色胺箱圖及ROC曲線Fig 3 Boxplots and ROC curve of 5-HT level in healthy people and SCAP patients with different prognosis

表2 5-HT的獨立因子檢驗Table 2 Independent factor test of 5-HT for prognosis

表3 SCAP患者基本信息和臨床指標(biāo)Table 3 Basic information and clinical indicators of SCAP patients

本文研究的患者人群為重癥社區(qū)獲得性肺炎，并沒有研究中度和輕度社區(qū)獲得性肺炎以及醫(yī)院獲得性肺炎的患者，具有一定的局限性。未來可納入不同嚴(yán)重程度和醫(yī)院獲得性肺炎的患者人群，探尋5-HT是否適用于此類人群，增加5-HT的適用范圍。

A.5-HT level of plasma was positive correlated with OI,r=0.356,P=0.002 9;B.5-HT level of plasma was negative correlated with APACHE Ⅱ score,r=-0.428,P=0.000 3;Pearson rank correlation analy-sis (r) and P value were provided in each graph圖4 SCAP血漿5-HT水平與氧合指數(shù)和APACHE Ⅱ評分的相關(guān)性圖Fig 4 Correlation graphs of 5-HT level of plasma and OI,APACHE Ⅱ score in SCAP patients