孫靖玉，姚 赫，胡 剛，魏 潔，郭 君，張 鑫，林雅軍

(北京醫(yī)院 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

衰老(aging)是慢性疾病發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，影響包括心血管系統(tǒng)、肌肉和骨骼在內(nèi)的各種組織[1]。血管衰老是多種心血管病變的基礎(chǔ)，如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、心肌梗死、心力衰竭等[2]。由于動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病是全世界死亡的主要原因[3]，而且內(nèi)皮細(xì)胞衰老是血管疾病的一個(gè)關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[4]，因此,迫切需要研究預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞衰老的方法。KNDC1[kinase non-catalytic C-lobe domain (KIND) containing 1]是一種Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(RasGEF)，包含兩個(gè)激酶非催化c-葉結(jié)構(gòu)域(KIND)的串聯(lián)重復(fù)序列，被認(rèn)為與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KNDC1能夠促進(jìn)HUVECs衰老[6]。但是敲除KNDC1是否能夠延緩HUVECs衰老尚不明確。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA[7]，其利用single向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)介導(dǎo)的Cas9蛋白對(duì)基因組DNA特異性地切割[8]。因此本研究將利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除HUVECs的KNDC1，并觀察敲除KNDC1后HUVECs的抗衰老能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為本室從臍靜脈中分離，用含10%胎牛血清、100 U青霉素、100 U鏈霉素、含表皮生長(zhǎng)因子的ECM培養(yǎng)基(ScienCell公司) 在37 ℃、5% CO2孵箱(Thermo Fisher Scientificals公司)中傳代培養(yǎng)。人宮頸癌細(xì)胞系HeLa(HeLa細(xì)胞)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)用含10%胎牛血清、100 U青霉素、100 U鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.1.2 載體和試劑：Guide-it CRISPR/Cas9 Systems質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒、一步法RT-qPCR試劑盒(TaKaRa公司)。BCA 試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME、Trizol(Thermo Fisher Scientificals公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶有限責(zé)任公司)；抗KNDC1抗體、2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針(Sigma-Aldrich公司)；抗β-actin抗體(Santa Cruz公司)；山羊抗兔的二抗(北京中杉金橋生物有限公司)；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒(SA-β-gal)(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 引物合成和測(cè)序：所有引物與寡核苷酸的合成及樣品測(cè)序均由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA打靶載體的構(gòu)建:利用麻省理工大學(xué)張峰實(shí)驗(yàn)室提供的網(wǎng)絡(luò)工具(http://crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)KNDC1的sgRNA，在正義鏈模板的5′端添加 CCGG；反義鏈模板的5′端添加 AAAC，以便與線性CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體的黏性末端互補(bǔ)。根據(jù)KNDC1蛋白的結(jié)構(gòu)域功能，分別設(shè)計(jì)了靶向KNDC1-Exon1/2/3的5個(gè) sgRNAs(表1)，分別命名為KNDC1-sgRNA1、KNDC1-sgRNA2、KNDC1-sgRNA3、KNDC1-sgRNA4和KNDC1-sgRNA5。

sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈：將合成的寡核苷酸用DEPC水進(jìn)行重懸，使其終濃度為100 μmol/L。取上游鏈和下游鏈各1 μL，補(bǔ)加8 μL的退火緩沖液組成10 μL體系。按以下程序進(jìn)行退火：95 ℃ 2 min，85 ℃降溫至30 ℃，梯度為10 min，25 ℃保持。將退火后的寡核苷酸用退火緩沖液稀釋至100 nmol/L。連接載體：線性化pGuide-it-ZsGreen1 載體質(zhì)粒2 μL(7.5 ng/μL)，退火后sgRNA寡核苷酸雙鏈或Guide-it 對(duì)照退火寡核苷酸雙鏈1 μL(100 nmol/L)，補(bǔ)水至2 μL，加入5 μL DNA連接混合物[取于Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green)]，16 ℃ 孵育30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，1 mL SOC培養(yǎng)液37 ℃水浴1 h；氨芐抗性平板篩選，37 ℃ 倒置培養(yǎng)過夜后挑取單克隆，按照質(zhì)粒小提步驟提取質(zhì)粒，送北京生工測(cè)序驗(yàn)證。

表1 靶向KNDC1-Exon1/2/3的sgRNA寡核苷酸序列Table 1 Oligo sequences of sgRNA targeting KNDC1-Exon1/2/3

1.2.2 在HeLa細(xì)胞中驗(yàn)證打靶載體的敲除效率:將HeLa細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h 后分別取上述構(gòu)建好的打靶載體及對(duì)照載體用jet PRIME轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞，通過熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞RNA和總蛋白，試驗(yàn)步驟參照Trizol試劑說明書和哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解試劑說明書。然后通過real-time PCR檢測(cè)KNDC1的轉(zhuǎn)錄水平，通過免疫印跡法檢測(cè)KNDC1蛋白的表達(dá)水平，以此來評(píng)估打靶載體的敲除效果。

1.2.3 在HUVECs中進(jìn)行KNDC1敲除:將HUVECs接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h 后分別轉(zhuǎn)染經(jīng)HeLa細(xì)胞驗(yàn)證的敲除效果好的KNDC1重組載體和對(duì)照重組載體，轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞RNA和總蛋白，然后通過real-time PCR檢測(cè)KNDC1的轉(zhuǎn)錄水平，通過免疫印跡法檢測(cè)KNDC1蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4 SA-β-gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老:將HUVECs接種于6孔板，分別用KNDC1重組載體和對(duì)照重組載體轉(zhuǎn)染HUVECs，換M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，然后按照SA-β-gal染色試劑盒說明書進(jìn)行衰老檢測(cè)。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:分別轉(zhuǎn)染KNDC1重組載體和對(duì)照重組載體的HUVECs接種于96孔板，設(shè)復(fù)孔6個(gè)，通過MTT法每日檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，連續(xù)8 d。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè):轉(zhuǎn)染細(xì)胞同1.2.5，然后根據(jù)制造商的說明用10 μmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針在37 ℃下染色30 min。染色后，用PBS洗滌細(xì)胞，然后通過熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 用于人 KNDC1敲除的打靶載體的構(gòu)建

合成的5個(gè)sgRNAs寡核苷酸序列及對(duì)照寡核苷酸序列與線性質(zhì)粒pGuide-it-ZsGreen1 載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，挑選氨芐抗性陽性克隆質(zhì)粒送北京生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的陽性質(zhì)粒分 別 名 為 Cas9-KNDC1-sgRNA1、Cas9-KNDC1-sgRNA2、Cas9-KNDC1-sgRNA3、Cas9-KNDC1-sgRNA4、Cas9-KNDC1-sgRNA5及Cas9-KNDC1-Con(圖1，2)。

2.2 篩選打靶效率高的重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)85%(圖3A)，重組質(zhì)粒1、2、3、4和5轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞KNDC1 mRNA水平較對(duì)照組顯著降低(圖3B)(P<0.05)；靶基因KNDC1在191和54 ku處蛋白表達(dá)水平也較對(duì)照組均有顯著降低(圖3C)；其中重組質(zhì)粒Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5打靶效率更高(P<0.01)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用重組質(zhì)粒4和5進(jìn)行研究。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig 1 Construction schematic of plasmid

圖2 陽性克隆測(cè)序結(jié)果Fig 2 Sequencing results of positive clones in Escherichia coli

A.transfection efficiency of recombinant plasmid (×100);B.expression of KNDC1 mRNA after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;C.expression of KNDC1 protein after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;*P<0.05 compared with control group;**P<0.01 compared with control group;0=Cas9-KNDC1-control;1=Cas9-KNDC1-sgRNA1;2=Cas9-KNDC1-sgRNA2;3=Cas9-KNDC1-sgRNA3;4=Cas9-KNDC1-sgRNA4;5=Cas9-KNDC1-sgRNA5圖3 KNDC1在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平Fig 3 Transcription and expression levels of KNDC1 in HeLa n=3)

2.3 在HUVECs中對(duì)KNDC1進(jìn)行敲除驗(yàn)證

上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs，轉(zhuǎn)染效率約為65%(圖4A)，重組質(zhì)粒4和5轉(zhuǎn)染的HUVECs KNDC1 mRNA水平較對(duì)照組顯著降低(圖4B)(P<0.05)；靶基因KNDC1在191和54 ku處蛋白表達(dá)水平也較對(duì)照組均有顯著降低(圖4C)。

2.4 敲除KNDC1能夠延緩HUVECs衰老、增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力及降低其活性氧水平

與轉(zhuǎn)染Cas9-KNDC1-Con質(zhì)粒的HUVECs(衰老細(xì)胞百分率為64.0%)相比，轉(zhuǎn)染Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5質(zhì)粒的HUVECs衰老細(xì)胞數(shù)顯著降低，分別為3.8%和4.5%(圖5A),細(xì)胞增殖能力有明顯增強(qiáng)(圖5B)。與轉(zhuǎn)染Cas9-KNDC1-Con質(zhì)粒的HUVECs(活性氧染色陽性細(xì)胞百分率49.4%)相比，轉(zhuǎn)染Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5質(zhì)粒的HUVECs衰老活性氧水平也有顯著降低，分別為3.8%和3.5%(圖6)。

3 討論

心血管系統(tǒng)的正常功能對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)和提高機(jī)體的最大壽命至關(guān)重要。血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老是動(dòng)脈粥樣硬化及其他年齡相關(guān)心血管疾病的基礎(chǔ)[9-10]。KNDC1是2006年發(fā)現(xiàn)的基因，日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，其能負(fù)調(diào)控神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)，這一功能與Ras鳥苷酸交換因子活性和蛋白絲/蘇氨酸激酶活性相關(guān)[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KNDC1會(huì)使HUVECs衰老細(xì)胞數(shù)增加[6]，KNDC1 siRNA 處理內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[13]。但是在HUVECs中敲除KNDC1后，其抗衰老能力是否增強(qiáng)尚未見報(bào)道。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了5種人KNDC1敲除重組質(zhì)粒。該技術(shù)是近年來新興的，高效的基因編輯技術(shù)；是由sgRNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行編輯；其不會(huì)將外源基因整合到細(xì)胞基因組上，生物安全性較高[14-15]。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒序列正確后，分別將5種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率高達(dá)85%。本研究首先選擇HeLa細(xì)胞驗(yàn)證重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，是因?yàn)橘|(zhì)粒容易轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞。接下來通過real-time PCR和Western blot進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5種質(zhì)粒均能顯著降低KNDC1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平(P<0.05)，其中重組質(zhì)粒4和5敲除效率較高。因此本實(shí)驗(yàn)將在HUVECs中對(duì)質(zhì)粒4和5進(jìn)行研究。

A.transfection efficiency of recombinant plasmid (×100);B.expression of KNDC1 mRNA after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;C.expression of KNDC1 protein after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;*P<0.01 compared with control group;0=Cas9-KNDC1-control;4=Cas9-KNDC1-sgRNA4;5=Cas9-KNDC1-sgRNA5圖4 KNDC1在HUVECs中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平Fig 4 Transcription and expression levels of KNDC1 in n=3)

將重組質(zhì)粒4和5轉(zhuǎn)染HUVECs后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率為65%，低于HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，可能是由于質(zhì)粒較難進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞所致；通過real-time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KNDC1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平顯著降低，但并未完全敲除，可能是由于小部分HUVECs沒有重組質(zhì)粒進(jìn)入所致。后續(xù)研究將考慮構(gòu)建KNDC1敲除腺病毒載體來增加敲除效率。此外通過SA-β-gal染色和MTT法實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KNDC1敲除后內(nèi)皮細(xì)胞衰老數(shù)顯著減少、細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，DCFH-DA熒光探針染色結(jié)果顯示，ROS水平顯著降低。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步研究KNDC1影響細(xì)胞衰老的信號(hào)通路，對(duì)其作用機(jī)制做進(jìn)一步的探討。

綜上所述，本研究采用了CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建出重組人KNDC1-Cas9敲除載體。構(gòu)建的人KNDC1-Cas9敲除載體可用于HUVECs中KNDC1的敲除，將為研究KNDC1在細(xì)胞衰老方面的作用提供可靠的技術(shù)支持。