馮寶寶，趙 瑩，馬曉宇，寧麗麗，趙國(guó)琦，霍永久

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.上海新邦生物科技有限公司，上海 200000)

斷奶是生豬養(yǎng)殖過(guò)程中的必經(jīng)階段?，F(xiàn)代化養(yǎng)殖場(chǎng)為提高母豬利用率，增強(qiáng)仔豬的生產(chǎn)性能，普遍采用仔豬早期斷奶技術(shù)。仔豬早期斷奶，飼料液固轉(zhuǎn)變應(yīng)激較大，易破壞腸組織免疫屏障功能，并且早期斷奶時(shí)仔豬主動(dòng)免疫機(jī)能尚未發(fā)育完全，又受斷奶應(yīng)激影響更加降低了自身抗體水平，致使仔豬對(duì)病原菌的抵抗力下降，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉發(fā)生[1]。生產(chǎn)中抗生素可有效減緩斷奶應(yīng)激的危害，但抗生素的過(guò)渡使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等系列問(wèn)題。有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬機(jī)體的免疫水平與飼糧營(yíng)養(yǎng)組成有著密切的聯(lián)系，合理的飼糧組成是仔豬健康高產(chǎn)的關(guān)鍵[2]。因此，通過(guò)優(yōu)化飼料結(jié)構(gòu)來(lái)減緩仔豬斷奶應(yīng)激綜合征的發(fā)生是有效方法。

教槽料中蛋白源的優(yōu)劣，直接影響斷奶仔豬的健康水平。豆粕在斷奶仔豬日糧中應(yīng)用較廣，但豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]，對(duì)仔豬成長(zhǎng)十分不利。豆粕經(jīng)發(fā)酵酶解后，可有效降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量[4-5],并且將大分子蛋白降解為低分子蛋白和小肽，有利于仔豬吸收[6]。酵母提取物和小麥水解蛋白作為優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白原料，在日糧中適量添加可為斷奶仔豬補(bǔ)必需氨基酸、核苷酸和谷氨酰胺，促進(jìn)仔豬小腸上皮細(xì)胞的增殖、分化，增強(qiáng)腸道正常的生理功能[7-11]。有研究顯示，用19.51%的發(fā)酵酶解豆粕替換日糧中的普通豆粕飼喂仔豬，其平均日增質(zhì)量、血清蛋白濃度、白球比分別提高了14.51%、18.73%和11.11%，料重比和腹瀉率分別降低了9.50%和29.10%[12]。斷奶仔豬日糧中添加酵母提取物和小麥水解蛋白等飼料蛋白原料，可顯著改善斷奶仔豬腸道和免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體免疫機(jī)能，降低腹瀉率[13-15]。

生產(chǎn)中許多飼料添加劑具有腸道調(diào)節(jié)功能，在斷奶仔豬日糧中使用可顯著提高機(jī)體免疫機(jī)能、調(diào)節(jié)腸道菌群。益生菌作為機(jī)體有益活性菌，可通過(guò)抑制腸道病原菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道固有菌群的活性，保護(hù)機(jī)體免受斷奶應(yīng)激的危害[16]。植物精油作為飼料添加劑，具有廣泛的抑菌、抗氧化、抗炎作用，是目前最有潛力代替抗生素的天然無(wú)害物[17]。宋轉(zhuǎn)等[18]研究發(fā)現(xiàn),在仔豬日糧中添加50 mg/kg的復(fù)合植物精油能夠有效緩解仔豬氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腸道損傷。蔣志等[19]研究表明，飼料中添加0.08%的包被精油復(fù)合酸有增強(qiáng)斷奶仔豬免疫力的趨勢(shì)。飼糧中優(yōu)質(zhì)蛋白源的選擇和腸道保護(hù)劑的添加對(duì)斷奶仔豬腸道健康起著重要的作用，目前仔豬日糧中添加的蛋白源、微生態(tài)制劑、植物精油、酸化劑等組合單一，而將它們?nèi)媾浔冉M合后對(duì)仔豬腸道黏膜免疫屏障機(jī)能影響的研究較少。為此，在仔豬日糧中添加優(yōu)質(zhì)蛋白原料，且將益生菌、植物精油、酸化劑等配比混合添加到飼糧中，研究它們共同作用對(duì)斷奶仔豬腸道黏膜炎癥因子和緊密連接蛋白基因表達(dá)量的影響，以期為無(wú)抗生素時(shí)代仔豬的健康高效生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵酶解豆粕、酵母提取物、小麥水解蛋白粉、腸道保護(hù)包均由上海新邦生物科技有限公司提供。腸道保護(hù)包成分為復(fù)合酸化劑、植物精油和復(fù)合益生菌組合。復(fù)合酸化劑：總酸(以乳酸計(jì))含量≥70%，其中乳酸≥35%，檸檬酸≥28%，富馬酸≥2%；植物精油：肉桂醛15%～25%，百里香酚3%～5%，香芹酚3%～5%，丁香酚3%～5%，其余為載體二氧化硅，明膠，變性淀粉，硬脂酸；復(fù)合益生菌：有效活菌含量≥1×1010cfu/g，乳酸菌活菌數(shù)≥1×109cfu/g，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)≥1×109cfu/g，酵母菌活菌數(shù)≥1×109cfu/g)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選取90頭21日齡體質(zhì)量[(6.85±0.25)kg]相近的杜洛克×長(zhǎng)白×大約克斷奶仔豬，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬。對(duì)照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧；優(yōu)質(zhì)蛋白源組(HP組)：基礎(chǔ)飼糧中添加優(yōu)質(zhì)蛋白原料(基礎(chǔ)飼糧中的豆粕蛋白原料被發(fā)酵酶解豆粕、酵母提取物和小麥水解蛋白粉所代替)；優(yōu)質(zhì)蛋白源+腸道保護(hù)包組(HPP組)：基礎(chǔ)飼糧中添加優(yōu)質(zhì)蛋白原料和腸道保護(hù)包，預(yù)飼7 d，試驗(yàn)期共14 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)營(yíng)養(yǎng)需要配置的粉狀配合飼料，原料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)豬自由采食和飲水，防疫消毒均按豬場(chǎng)管理規(guī)程進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.4 試驗(yàn)方法

在仔豬斷奶0、3、7、14 d，仔豬空腹12 h，每組隨機(jī)抽取3頭試驗(yàn)豬屠宰，分離腸道，刮取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸黏膜，在液氮中保存。使用天根組織RNA提取試劑盒提取空腸、回腸、結(jié)腸黏膜凍存樣RNA。使用One Drop紫外超微量分光光度儀測(cè)定RNA的濃度和純度。使用的Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有操作均在冰上進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：總RNA為500 ng、5×Prime Script RT Master Mix 2 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)足到10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s，cDNA在-20 ℃冰箱待測(cè)。通過(guò)NCBI PubMed軟件設(shè)計(jì)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10、ZO-1、Occludin、Claudin-1基因的特異性引物，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板100 ng、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL、上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、滅菌蒸餾水補(bǔ)足20 μL體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。使用GAPDH作為內(nèi)參，采用△△CT法檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR中各基因表達(dá)的相對(duì)差異；△△CT=(CT目的基因-CTGAPDH)處理組-(CT目的基因-CTGAPDH)對(duì)照組，計(jì)算2-△△CT得到目的基因在各組中的相對(duì)表達(dá)水平。

表2 qRT-PCR中基因引物序列Tab.2 Sequences of gene primers for qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013進(jìn)行初步整理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同教槽料對(duì)斷奶0、3、7、14 d仔豬腸道黏膜TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10基因表達(dá)的影響

2.1.1 仔豬斷奶0 d 由圖1可知，仔豬斷奶0 d時(shí)，十二指腸中HPP組TGF-β的基因表達(dá)量顯著高于CON組和HP組(P<0.05)；空腸、回腸、結(jié)腸TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

不同字母表示不同組別間存在顯著差異(P<0.05)，下同

2.1.2 仔豬斷奶3 d 由圖2可知，仔豬斷奶3 d時(shí)，十二指腸中HP組和HPP組IL-1β的基因表達(dá)量均高于CON組(P<0.05)；回腸中HP組和HPP組IL-1β的基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；結(jié)腸中，HP組和HPP組TNF-α、TGF-β、IL-10的基因表達(dá)量均高于CON組，且達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

2.1.3 仔豬斷奶7 d 由圖3可知，仔豬斷奶7 d時(shí)，空腸中HP組和HPP組TNF-α和IL-10的基因表達(dá)量顯著高于CON組(P<0.05)；回腸中HP組和HPP組TNF-α和IL-10的基因表達(dá)量顯著高于CON組(P<0.05)，HP組IL-1β、TGF-β的基因表達(dá)量顯著高于CON組；結(jié)腸中HP組和HPP組IL-1β和IL-10的基因表達(dá)量均高于CON組(P>0.05)。

圖2 不同教槽料對(duì)斷奶3 d仔豬十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)黏膜

圖3 不同教槽料對(duì)斷奶7 d仔豬十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)黏膜

2.1.4 仔豬斷奶14 d 由圖4可知，仔豬斷奶14 d時(shí)，空腸中HP組和HPP組TNF-α、IL-1β基因表達(dá)量均顯著高于CON組(P<0.05)，HPP組TGF-β基因表達(dá)量顯著高于CON組和HP組(P<0.05)，HPP組IL-10基因表達(dá)量高于CON組(P<0.05)；回腸中HP組和HPP組TGF-β基因表達(dá)量均顯著高于CON組(P<0.05)；十二指腸和結(jié)腸黏膜各組間TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同教槽料對(duì)斷奶14 d仔豬十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)黏膜

2.2 不同教槽料對(duì)斷奶0、3、7、14 d仔豬腸道黏膜屏障功能相關(guān)基因Occludin、Claudin-1、ZO-1表達(dá)量的影響

2.2.1 仔豬斷奶0 d 由圖5可知，仔豬斷奶0 d時(shí)，回腸中HP組和HPP組Occludin、ZO-1的基因表達(dá)量均高于CON組(P>0.05)。結(jié)腸中HP組和HPP組Claudin-1的基因表達(dá)量顯著高于CON組(P<0.05)。

2.2.2 仔豬斷奶3 d 由圖6可知，仔豬斷奶3 d時(shí),回腸和結(jié)腸中Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量相比于斷奶0 d均有所上升?；啬c中HP組和HPP組Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量均高于CON組(P<0.05)。結(jié)腸中HP組和HPP組Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量顯著高于CON組(P<0.05)。

2.2.3 仔豬斷奶7 d 由圖7可知，仔豬斷奶7 d時(shí)，回腸HP組和HPP組Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量顯著高于CON組(P<0.05)，且HP組表達(dá)量最高。結(jié)腸中各組間Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2.4 仔豬斷奶14 d 由圖8可知，仔豬斷奶14 d時(shí)，回腸中HP組和HPP組ZO-1的基因表達(dá)量高于CON組(P>0.05)。結(jié)腸中HPP組Occludin和Claudin-1的基因表達(dá)量均高于CON組和HP組(P>0.05)，HP組ZO-1的基因表達(dá)量高于其他兩組(P>0.05)。

圖5 不同教槽料對(duì)斷奶0 d仔豬回腸(A)、結(jié)腸(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes in ileum(A) and colon(B) mucosa of 0 day weaned piglets

圖6 不同教槽料對(duì)斷奶3 d仔豬回腸(A)、結(jié)腸(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes in ileum(A) and colon(B) mucosa of 3 days weaned piglets

圖7 不同教槽料對(duì)斷奶7 d仔豬回腸(A)、結(jié)腸(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes in ileum(A) and colon(B) mucosa of 7 days Weaned Piglets

圖8 不同教槽料對(duì)斷奶14 d仔豬回腸(A)、結(jié)腸(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes inileum(A) and colon(B) mucosa of 14 days weaned piglets

3 結(jié)論與討論

3.1 不同教槽料對(duì)斷奶仔豬腸道黏膜細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)的影響

動(dòng)物體中的細(xì)胞因子是一類(lèi)胞外蛋白或糖蛋白，具有來(lái)源范圍廣、功能多等特點(diǎn)，能夠激發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的修復(fù)功能，參與細(xì)胞凋亡、修復(fù)、增殖和分化等。機(jī)體中具有傳遞抗原信息、誘導(dǎo)促進(jìn)其他淋巴細(xì)胞活性的T淋巴細(xì)胞稱(chēng)為輔助性T細(xì)胞(Th)，根據(jù)不同功能將輔助性T細(xì)胞分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞[20]，腸道Th1細(xì)胞因子有IL-1β、TNF-α、IFN-γ等促炎因子，Th2細(xì)胞因子有IL-4、IL-10等抗炎因子，機(jī)體在正常狀態(tài)下Th1/Th2型免疫應(yīng)答系統(tǒng)保持著動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系[21]。TGF-β是由激活的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有控制免疫細(xì)胞增殖、分化和活化，降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生的作用。

仔豬斷奶后，由于斷奶應(yīng)激，機(jī)體中與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路如NF-κB等被激活，引發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致機(jī)體炎癥的發(fā)生[22-23]。本試驗(yàn)中仔豬斷奶0 d時(shí)，各組間空腸、回腸、結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表達(dá)量無(wú)顯著差異，而在斷奶3 d和7 d時(shí)，受斷奶應(yīng)激的影響，機(jī)體已激活自身免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表達(dá)量均上調(diào)，其中以HP組和HPP組上調(diào)最明顯，直至斷奶14 d時(shí)，空腸中細(xì)胞因子的表達(dá)量仍是顯著高于對(duì)照組的。HP組和HPP組仔豬腸道黏膜促炎因子、抗炎因子基因水平相比于CON組均有所提高，以HPP組提高最為明顯。PIE等[24]發(fā)現(xiàn)，仔豬在斷奶后腸道黏膜受到采食轉(zhuǎn)變的應(yīng)激會(huì)發(fā)生短暫的炎癥反應(yīng)，在斷奶14 d內(nèi)會(huì)上調(diào)腸黏膜促炎因子IL-1β和IL-6的基因表達(dá)量。原偉偉等[25]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中添加谷氨酰胺、小麥水解蛋白可顯著提高仔豬血清中IL-1β的含量，但I(xiàn)L-6和TNF-α的變化不是很顯著，表明谷氨酰胺和小麥水解蛋白可以刺激細(xì)胞因子的分泌。劉虎傳等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加益生菌，可顯著提高血清中IL-1、IL-6和TNF-α的含量，表明仔豬日糧中添加益生菌能夠刺激機(jī)體細(xì)胞因子的分泌，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果較為一致。本試驗(yàn)中，雖然HP組和HPP組腸道促炎因子TNF-α、IL-1β的基因表達(dá)量有所提高，但同時(shí)TGF-β、IL-10的基因表達(dá)量也是升高的，并沒(méi)有打破Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡。HP組和HPP組腸道黏膜中較高的細(xì)胞因子表達(dá)量說(shuō)明這兩組斷奶仔豬機(jī)體的免疫機(jī)能增強(qiáng)，證明教槽料中使用優(yōu)質(zhì)蛋白源和腸道保護(hù)包能增強(qiáng)仔豬免疫器官的發(fā)育，增加免疫細(xì)胞數(shù)量，提高腸道黏膜免疫屏障的功能。

3.2 不同教槽料對(duì)斷奶仔豬腸道黏膜屏障功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

腸道黏膜的緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)是機(jī)體防御病原菌進(jìn)入的重要屏障，它是腸黏膜細(xì)胞間的重要連接方式[27]。Claudin、Occludin和ZO-1是決定腸黏膜完整性和通透性的重要分子[28]。緊密連接蛋白之間結(jié)合形成緊密連接蛋白復(fù)合物并與細(xì)胞骨架相連，維持細(xì)胞間的緊密連接，發(fā)揮細(xì)胞屏障功能。有研究者發(fā)現(xiàn)，用輪狀病毒對(duì)斷奶仔豬進(jìn)行攻毒，18 d后檢測(cè)到回腸黏膜中ZO-1和Occludin的基因表達(dá)量均顯著降低[29]。YAN等[30]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K88感染的仔豬腸道ZO-1的表達(dá)量顯著降低。由此可以得出，當(dāng)動(dòng)物在受到病毒和細(xì)菌感染時(shí)，其緊密連接蛋白的表達(dá)量便會(huì)降低。本試驗(yàn)中仔豬斷奶3 d時(shí)，HP組和HPP組仔豬的回腸和結(jié)腸中Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，并且在斷奶7 d時(shí)，回腸中Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表達(dá)量仍處在較高水平。斷奶后3～7 d是斷奶應(yīng)激的主要階段，而此時(shí)HP組和HPP組顯著上調(diào)了腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量，說(shuō)明HP組和HPP組飼喂的教槽料可積極應(yīng)對(duì)斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的大腸桿菌和病毒感染，使仔豬在斷奶階段可以平穩(wěn)過(guò)渡。

綜上所述，教槽料中使用優(yōu)質(zhì)蛋白源和腸道保護(hù)包可上調(diào)腸道黏膜細(xì)胞因子相關(guān)基因的表達(dá)量，提高機(jī)體免疫機(jī)能。HP組和HPP組飼喂的教槽料還可增強(qiáng)仔豬腸黏膜中緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量，增強(qiáng)仔豬腸道的屏障功能，降低病原菌入侵仔豬腸道的風(fēng)險(xiǎn)。