周大鵬，藍(lán)蔚青,2，3*，莫雅嫻，梅俊,2，3，馮豪杰，謝晶,2，3*

1(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306)

海鱸魚(Lateolabraxjaponicas)又名花鱸、四肋魚，屬鱸形目重要經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布于我國黃海、渤海地區(qū)。因其肉嫩味鮮，富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸和維生素等營養(yǎng)成分，深受消費(fèi)者歡迎[1]?！?019年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[2]顯示，我國2018年鱸魚海水養(yǎng)殖量達(dá)166 581噸，比2017年增長了6.38%，產(chǎn)量僅次于大黃魚，其資源重要性不言而喻。然而，由于海鱸魚等水產(chǎn)品的水分含量高，蛋白質(zhì)易受內(nèi)源酶與微生物影響發(fā)生降解，使其營養(yǎng)價值降低，繼而發(fā)生腐敗[2]。因此，在加工銷售過程中，保證其新鮮口感與質(zhì)量安全成為亟需解決的主要問題，采用簡單有效且安全方便的處理措施對海鱸魚的貯藏保鮮具有重要意義。

超聲波是一種機(jī)械波，分為高頻低強(qiáng)度(頻率100 kHz～1 MHz，強(qiáng)度<1 W/cm2)與低頻高強(qiáng)度(頻率16 k～100 kHz，強(qiáng)度10～1 000 W/cm2)[3]。該技術(shù)屬新型高效、綠色環(huán)保的加工處理技術(shù)，其作用機(jī)制是通過超聲技術(shù)的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)與化學(xué)效應(yīng)，使樣品組織產(chǎn)生物理破壞而發(fā)揮作用[4]。目前，超聲處理技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品殺菌、肉類腌制與嫩化加速等方面[5-6]。其中，李長樂等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鰹魚的肌原纖維蛋白經(jīng)超聲(20 kHz, 12 min)處理后，會改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高肌原纖維蛋白溶解度與乳化性，分子質(zhì)量保持不變；WANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，牛肉經(jīng)超聲處理后，其肌原纖維分裂指數(shù)增加，蛋白質(zhì)水解速度加快，剪切力降低，可有效改善牛肉嫩度。此外，超聲還具有殺菌作用，該技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)空化效應(yīng)，而空化氣泡破裂時會生成羥基自由基，經(jīng)重組形成過氧化氫與氫分子，具有化學(xué)抑菌效應(yīng)，使菌體細(xì)胞膜變薄[9]。如PEDRS-GARRIDO等[10]使用30 kHz超聲處理鮭魚45 min，發(fā)現(xiàn)鮭魚的嗜冷菌與嗜溫菌數(shù)分別減少了1.5與1.1個對數(shù)值。而超聲前處理對海鱸魚冷藏期間品質(zhì)及蛋白質(zhì)特性變化研究還未見報道。

基于此，本實驗擬采用超聲法處理鮮海鱸魚，由微生物、理化與蛋白質(zhì)特性等指標(biāo)，結(jié)合蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度與感官分析綜合評價超聲處理不同時間對冷藏鱸魚貯藏期間品質(zhì)與蛋白質(zhì)特性影響，以期為超聲技術(shù)在水產(chǎn)品減菌化前處理與貯藏保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

鮮活海鱸魚(Lateolabraxjaponicas)購于上海市浦東新區(qū)蘆潮港海鮮批發(fā)市場，選擇體長(340±20 mm)，體重(500±30)g，樣品個體均一，30 min內(nèi)運(yùn)回實驗室進(jìn)行實驗。

1.2 主要藥品試劑

Ca2+-ATPase測定試劑盒、總巰基(—SH)測定試劑盒，南京建成生物科技有限公司；乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、H2O2、MgO、KCl、FeCl3、NaCl、NaHPO4、NaH2PO4等，均為分析純，國藥集團(tuán)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)(H-2050R)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；超聲波清洗器(KQ-300DE)，昆山市超聲儀器有限公司；pH/ORP計(FE20)，上海而立環(huán)保科技有限公司；熒光分光光度計(日立F-7100)，上海斯邁歐分析儀器有限公司；凱氏定氮儀(Kjeltec8400)，丹麥FOSS公司；質(zhì)構(gòu)儀(TA.XT Plus)，英國Stable Micro System公司。

1.4 原料處理

將鮮活海鱸魚放入盛滿碎冰的泡沫箱中致死，去頭、去尾、去內(nèi)臟后，由中部切分成兩片，于無菌蒸餾水中清洗干凈，瀝干水分，隨機(jī)分為4組。使用20 kHz，600 W超聲處理5、10、20 min，分別記作U1、U2、U3，未超聲的無菌水處理組樣品為對照組(CK)。將4組樣品處理后取出瀝干，將其裝入無菌保鮮袋中并做好標(biāo)記，于4 ℃冰箱中貯藏。每隔2 d測定指標(biāo)，不同組別測定時，取樣部位保持一致。

1.5 實驗方法

1.5.1 微生物指標(biāo)(菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù))

根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)的測定》[11]，稱取5 g魚肉于無菌均質(zhì)袋中，加入45 mL 0.85%無菌生理鹽水后拍打勻漿，以10倍梯度稀釋。取3個合適的稀釋度進(jìn)行培養(yǎng)，移取1 mL稀釋液于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，及時將15～20 mL不同瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，混合均勻。瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，放入相應(yīng)溫度下培養(yǎng)，菌落總數(shù)(total viable count,TVC)在30 ℃培養(yǎng)2 d后計數(shù)；嗜冷菌數(shù)(ssychrophile bacteria count,PBC)在7 ℃培養(yǎng)240 h計數(shù)。每個稀釋度做3個平行，結(jié)果以lg(CFU/g)表示。

1.5.2 品質(zhì)評價

1.5.1.1 pH值：按GB 5009.237——2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[12]測定樣品pH值。取5 g碎魚肉與45 mL蒸餾水置于燒杯中，混合均勻靜置30 min后過濾，濾液使用pH計測定，3次平行。

1.5.1.2 質(zhì)構(gòu)分析(texture profile analysis, TPA)：參照LI等[13]方法略作修改。

1.5.1.3 總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base-nitrogen, TVB-N)：參照GB 5009.228——2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[14]對不同貯藏時期的樣品予以分析，同一樣品平行測定3次。

1.5.3 蛋白質(zhì)特性

1.5.3.1 肌原纖維蛋白提?。簠⒖糒I等[15]方法略作修改，提取肌原纖維蛋白。

1.5.3.2 肌原纖維小片化指數(shù)(myofibril fragmentation index，MFI)：參考HOPKINS等[16]方法并作適當(dāng)修改，2 g魚肉加20 mL MFI提取緩沖液(0.1 mol/L KCl，1.0 mmol/L NaN3，1.0 mmol/L MgCl2，20 mmol/L K2HPO4，1.0 mmol/L EDTA，pH值為7.1，4 ℃)，12 000 r/min冰浴均質(zhì)(30 s/次，2次)，12 000 r/min冷凍離心15 min。重復(fù)上述步驟后于沉淀中加入15 mL MFI緩沖液，混勻后雙層紗布過濾，濾液為肌原纖維蛋白溶液。調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，采用雙縮脲法由酶標(biāo)儀測定540 nm處吸光度，按公式(1)計算MFI值。

IMF=OD540×200

(1)

式中:OD540為濾液在540 nm處的吸光度值。

1.5.3.3 Ca2+-ATPase活性

根據(jù)Ca2+-ATPase測定試劑盒說明書中步驟測定。

1.5.3.4 總巰基含量

根據(jù)總巰基(—SH)測定試劑盒說明書中步驟測定。

1.5.4 內(nèi)源性光譜分析

稱取一定量樣品于5 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液，取適量樣品置于熒光分光光度計中測定。分析條件為激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～400 nm，狹縫寬均為5 nm，電壓為700 mV。

1.5.5 感官分析

按照質(zhì)量指標(biāo)法(quality index method，QIM)[17]，參照藍(lán)蔚青等[18]方法評估各組樣品，將所有的指標(biāo)評分相加形成QI值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，方差分析采用Turkey法，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)

引起水產(chǎn)品蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝的主要因素是微生物，微生物的生長情況反映水產(chǎn)品的腐敗程度[19-20]，水產(chǎn)品中微生物的TVC對數(shù)值達(dá)7.0 lg(CFU/g)時表明樣品已腐敗[21]。由圖1可知，CK組樣品在貯藏初期的TVC值為(3.26±0.23) lg(CFU/g)，表明其鮮度較高；采用超聲處理后，各處理組樣品的TVC值在0 d時均有所降低，且U2、U3組樣品的TVC顯著低于CK組(P<0.05)。隨著冷藏時間的延長，各組樣品的TVC值逐漸升高，CK組樣品的TVC值上升趨勢顯著高于超聲處理組(P<0.05)。到貯藏第8 天時，CK組樣品的TVC值已達(dá)(7.25±0.06) lg(CFU/g)，而U2與U3組樣品仍處于新鮮范圍。樣品冷藏期間的PBC值變化與TVC值相似，也以U2與U3組處理效果較好，表明超聲處理可抑制海鱸魚貯藏期間微生物的生長速度，延長其冷藏貨架期，可用于其減菌化前處理。

圖1 超聲時間對海鱸魚冷藏期間菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)變化影響Fig.1 Effects of ultrasound time on the changes of TVC and PBC in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.2 pH值

pH值是衡量水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)之一。由圖2可知，樣品貯藏前期的pH值有所降低。可能由于水產(chǎn)品死后先后經(jīng)歷僵硬、解僵、自溶與腐敗等階段，在貯藏期間的pH值變化會出現(xiàn)先降后升變化趨勢。貯藏后期，由于蛋白質(zhì)分解釋放出胺類物質(zhì)，使得堿性物質(zhì)積累，從而導(dǎo)致pH值逐漸上升，pH值越高，表明其腐敗越嚴(yán)重[22]。樣品在貯藏第4 天時，U2組樣品的pH值升至7.00±0.07，可能由于超聲破壞了組織與細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使樣品的蛋白質(zhì)構(gòu)象隨之改變，導(dǎo)致酸性基團(tuán)埋藏，導(dǎo)致pH值上升[23]。U2組與U3組樣品的pH值在貯藏后期無顯著差異(P>0.05)，均低于對照組，表明超聲處理可適當(dāng)減緩樣品貯藏期間pH值的上升，抑制其腐敗。

圖2 超聲時間對海鱸魚冷藏期間pH值變化影響Fig.2 Effects of ultrasound time on the changes of pH value in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.3 TVB-N值

TVB-N是評價水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)，其值反映了貯藏期間樣品魚肉中蛋白質(zhì)等物質(zhì)在酶與細(xì)菌的作用下分解產(chǎn)生氨等揮發(fā)性堿類物質(zhì)的含量[24-25]。當(dāng)樣品的TVB-N值≤15 mg/100 g為優(yōu)級品，TVB-N值≤30 mg/100 g為合格品[26]。由圖3可知，CK組樣品的TVB-N值為(12.40±0.40) mg/100 g，表明樣品較新鮮。隨著貯藏時間的延長，各組樣品的TVB-N值均呈上升趨勢，3個處理組樣品的TVB-N值均低于CK組。CK組樣品在第6天時的TVB-N值達(dá)(18.37±1.52) mg/100 g，已超出優(yōu)級品范圍，而U2、U3組樣品的TVB-N值分別為(11.95±0.41) mg/100 g與(12.01±1.28) mg/100 g，仍屬優(yōu)級品。CK組樣品在貯藏第10 天時的TVB-N值已超出可接受上限，而U2、U3組均未達(dá)到該限值。可能由于超聲的殺菌作用，抑制了樣品中微生物生長，延緩其TVB-N值的升高[27]。該結(jié)果與TVC、PBC變化一致。

圖3 超聲時間對海鱸魚冷藏期間TVB-N值變化影響Fig.3 Effects of ultrasound time on the changes of TVB-N value in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.4 MFI值

MFI是反映肌原纖維斷裂程度的參數(shù)，也是表征肉品嫩度的重要指標(biāo)，其值與肌原纖維斷裂程度及肉品嫩度成正比[8]。由圖4可知，所有樣品MFI值均隨著貯藏時間的延長而升高，CK組樣品的MFI值與處理組差異顯著(P<0.05)，與HOPKINS等[28]研究結(jié)論相一致?？赡苡捎隰~體死后，肌肉中的鈣蛋白酶激活，引起Z盤相關(guān)肌原纖維蛋白降解，造成肌纖維斷裂[29]。其中，MFI值與超聲時間正相關(guān)，U3組樣品的MFI值顯著高于其他組，可能是處理時間越長，超聲波的空化效應(yīng)越強(qiáng)，使魚片肌原纖維與結(jié)締組織破壞嚴(yán)重，肌原纖維碎片化程度加快，MFI值相應(yīng)增大[23]。

圖4 超聲時間對海鱸魚冷藏期間MFI值變化影響Fig.4 Effects of ultrasound time on the changes of MFI value in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.5 Ca2+-ATPase活性

Ca2+-ATPase活性是用來評價肌球蛋白完整性的指標(biāo)，蛋白質(zhì)變性會導(dǎo)致酶活力改變[29]。由圖5可知，各組樣品的Ca2+-ATPase值隨著貯藏時間的增加呈下降趨勢，可能由于肌球蛋白球狀頭部上的巰基發(fā)生氧化和肌球蛋白聚集共同引起[30]。其中，U2與U3組樣品的Ca2+-ATPase值急劇下降，到貯藏第10天時，其Ca2+-ATPase活性分別降至0.42與0.48 U/mg。可能由于長時間超聲處理破壞了樣品中肌球蛋白的完整性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，酶活力降低[31]。

圖5 超聲時間對海鱸魚冷藏期間Ca2+-ATPase活性變化影響Fig.5 Effects of ultrasound time on the changes of Ca2+-ATPase activity in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.6 總巰基含量

巰基是蛋白質(zhì)中主要官能團(tuán)之一，其含量變化是評價肌肉蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)[32]。如圖6所示，各組樣品的總巰基含量隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢，總巰基減少代表二硫鍵增多[33]。其中，U3組樣品的巰基含量在整個貯藏期間下降迅速，到第10天時，其總巰基含量降至(2.45±0.11) μmol/g，而CK、U1、U2組分別為(3.89±0.23)、(3.50±0.56)和(3.21±0.30) μmol/g?？梢?，總巰基含量會隨超聲時間的延長而降低(P<0.05)，該結(jié)果與王靜宇等[34]一致。超聲處理會破壞樣品的蛋白結(jié)構(gòu)，且隨超聲時間的延長，其蛋白分子逐漸展開，內(nèi)部巰基相應(yīng)暴露，使活性巰基含量達(dá)到最大，促進(jìn)了二硫鍵的形成[35]。

圖6 超聲時間對海鱸魚冷藏期間總巰基含量變化影響Fig.6 Effects of ultrasound time on the changes of total sulfhydryl content in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.7 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光是指蛋白質(zhì)分子內(nèi)的熒光基團(tuán)暴露在紫外線時發(fā)出的熒光現(xiàn)象。熒光強(qiáng)度的降低通常由于發(fā)色團(tuán)在溶劑中或在蛋白質(zhì)自身中與猝滅劑發(fā)生相互作用，蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光轉(zhuǎn)移到表面，發(fā)生熒光猝滅[36]。因此，蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的變化可反映其構(gòu)象變化[37]。色氨酸作為一種芳香族氨基酸，存在于蛋白質(zhì)內(nèi)核中，可發(fā)出通過熒光光譜法測定其熒光強(qiáng)度，進(jìn)一步表征樣品蛋白質(zhì)的展開程度[38]。由圖7-a可知，新鮮樣品在335 nm波長處顯示出最高的熒光強(qiáng)度，表明其蛋白結(jié)構(gòu)完整度好。CK組樣品中肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在整個貯藏期間急劇下降，可能由于海鱸魚在貯藏期間，其肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開，色氨酸殘基等熒光物質(zhì)暴露在極性環(huán)境中，使內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低。而超聲處理可延緩樣品熒光強(qiáng)度的下降，可能由于超聲處理使色氨酸暴露于溶劑，發(fā)生熒光猝滅，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)解開。隨著處理時間的延長，其蛋白質(zhì)聚集程度加劇，色氨酸殘基重新定位至蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，熒光強(qiáng)度相應(yīng)增加[39]。

圖7 超聲時間對海鱸魚冷藏期間內(nèi)源熒光強(qiáng)度變化影響Fig.7 Effects of ultrasound time on the changes of intrinsic fluorescence in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.8 TPA

由圖8可知，各組魚肉的硬度值、黏性值和彈性值均隨著貯藏時間的延長而降低，這是源于貯藏期間的魚肉樣品蛋白質(zhì)在組織蛋白酶、內(nèi)源酶與微生物作用下發(fā)生不同程度的降解變性，肌纖維蛋白和肌肉結(jié)締組織遭到破壞，質(zhì)地變得松軟，質(zhì)構(gòu)特性顯著降低(P<0.05)[40]。樣品的初始硬度、彈性與黏性值分別為(12 056±1 051)N、0.79±0.06與0.42±0.07，整個貯藏期間U2、U3組的硬度值與CK組差異顯著(P<0.05)。CK組硬度較處理組均明顯偏大，表明超聲處理對魚肉的硬度影響較大，可改變?nèi)馄纺鄱?，該結(jié)果與MFI值變化一致。超聲波的空穴效應(yīng)會使肌肉內(nèi)部的壓力與沖力急劇增加，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與完整性，一定程度上降低肌肉蛋白的機(jī)械性能[41]。JAYASOORIYA等[42]發(fā)現(xiàn)超聲處理會降低牛肉剪切力與硬度、提高質(zhì)構(gòu)特性，改善品質(zhì)。

圖8 超聲時間對海鱸魚冷藏期間質(zhì)構(gòu)特性變化影響Fig.8 Effects of ultrasound time on the changes of TPA in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.9 感官分析

本文采用QIM法進(jìn)行感官評價，QI值為0時表示樣品品質(zhì)最佳，QI值增大則說明魚肉品質(zhì)發(fā)生劣變。由圖9可知，各組樣品的感官分值在貯藏期間均呈上升趨勢。其在貯藏初期差異不明顯；當(dāng)貯藏第4 天時，所有的處理組樣品的感官分值明顯低于CK組，而U2、U3組無顯著差異(P>0.05)。樣品在貯藏末期(8 d)時，出現(xiàn)不同程度的腐敗。此時，CK組樣品表面顏色黯淡，有濃烈的腥臭味，感官上已不可接受；U2、U3處理組樣品表面稍有發(fā)白，無腐敗氣味，仍處于鮮度范圍?？梢姡曁幚砜裳泳徍ｗ|魚樣品貯藏期間的腐敗變質(zhì)。

圖9 超聲時間對海鱸魚冷藏期間感官分值變化影響Fig.9 Effects of ultrasound time on the changes of sensory score in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.10 相關(guān)性分析

通過對不同超聲時間前處理后海鱸魚冷藏期間的TVC、TVB-N值、pH值、MFI值與硬度值進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2可知，MFI值是衡量肌原纖維平均長度的指標(biāo)，較高M(jìn)FI值表現(xiàn)為較大程度的肌原纖維斷裂，其與硬度值顯著相關(guān)(P<0.05)。超聲處理后魚片的MFI值均增加，從而硬度下降，嫩度增加[43]。

表2 超聲處理海鱸魚冷藏期間指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between different parameters of Lateolabrax japonicas with ultrasound treatment during refrigerated storage

TVB-N值表示樣品蛋白質(zhì)的分解程度，其與TVC、pH值等指標(biāo)顯著相關(guān)(P<0.05)，這是由于冷藏時間延長，樣品中的蛋白質(zhì)在微生物的作用下發(fā)生降解，含氮物質(zhì)相應(yīng)增多，pH值上升[44]。

3 結(jié)論

通過不同超聲時間處理后，研究其對海鱸魚冷藏期間品質(zhì)變化與蛋白質(zhì)變化影響，結(jié)果表明，超聲處理可較好抑制魚肉樣品貯藏期間的微生物生長，延緩pH值與TVB-N值升高，增大其MFI值，使硬度值降低，嫩度增加，改善肉質(zhì)。然而，長時間超聲處理會破壞樣品的蛋白結(jié)構(gòu)，使蛋白分子展開，促進(jìn)二硫鍵的形成，使Ca2+-ATPase活性與總巰基含量降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，超聲處理能減緩樣品中內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的降幅。其中，由TVC與TVB-N值，結(jié)合其他指標(biāo)可知，以超聲處理10 min綜合效果最佳。與對照組相比，該處理可使海鱸魚的冷藏貨架期至少延長2 d。因此，超聲處理能明顯改善水產(chǎn)品的貯藏品質(zhì)，延長其冷藏貨架期，可用于其貯藏前處理。