蟲草益腎顆粒劑的制備工藝研究*

贠 捷，王 旭，馮月男

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040）

慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）是指產(chǎn)生在各類慢性腎臟疾病后期的一種臨床綜合征[1]，已經(jīng)成為威脅公共衛(wèi)生的全球性熱點(diǎn)問題，可隨疾病逐漸進(jìn)展至終末期腎臟病階段。蟲草益腎方為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)宋立群教授基于祖國醫(yī)學(xué)對CRF的充分認(rèn)識(shí)，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)中醫(yī)學(xué)“升降浮沉”理論立法，創(chuàng)制而成，臨床以湯劑沖服蟲草被孢菌粉應(yīng)用，具有健脾益腎，祛瘀泄?jié)岬墓π?，適用于慢性腎臟病（2～4）期，臨床效果顯著。但湯劑由于受煎煮、攜帶、使用、儲(chǔ)藏等諸多方面的限制，使批量化生產(chǎn)受限。因此，將蟲草益腎方研制成既保留了湯劑的傳統(tǒng)方法，又在包裝上采用了單劑量包裝，使該藥更方便的服務(wù)于患者，同時(shí)可準(zhǔn)確控制劑量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

蟲草被孢菌粉（江蘇神華藥業(yè)有限公司）、黃芪、大黃、水蛭、腎茶（北京同仁堂）；1,8-二羥基蒽醌對照品（704-200115，中國藥品生物制品檢定所）；蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（MUST-11042915，中國藥品生物制品檢定所）；迷迭香酸對照品（111871-201802，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈和甲醇（色譜純，美國迪馬公司）；甲醇、甲酸均為分析純試劑；NaOH、NH4OH、HAc、正丁醇、乙醚、可溶性淀粉、糊精、羧甲基纖維素鈉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、甜蜜素（北京奧博生物技術(shù)責(zé)任有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters1515 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；UV-1601PC 紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；KKD-230HTDS 超聲波清洗機(jī)（東莞金科達(dá)超聲波科技有限公司）；PL602E 電子天平（瑞士梅特勒公司）；ATY124 電子分析天平（日本島津）；DK-S26DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏公司）；DZF6020 電熱恒溫減壓干燥箱（蘇州屹隆烘箱設(shè)備制造公司）；JW-DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海巨為儀器設(shè)備有限公司）；DZTW-1000 調(diào)溫電熱套（上海將來實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海耀特儀器設(shè)備有限公司）；電爐子；HY-02 粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司）；篩網(wǎng)（分樣篩，新鄉(xiāng)市秋田機(jī)械設(shè)備有限公司）；LDZ4-1 離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方組成

黃芪 30g、腎茶 20g、大黃 10g、水蛭 3g、蟲草被孢菌粉3g。

2.2 工藝路線擬定

根據(jù)組方中每一味藥物的有效成分、理化性質(zhì)等特點(diǎn)，擬定制備工藝路線:黃芪、水蛭、大黃、腎茶加水回流提取，濾過，濃縮，烘干，粉碎，均勻混入蟲草被孢菌粉，加輔料制粒、烘干、整粒，即得。

2.3 浸泡時(shí)間考察

7 份藥材（不含蟲草被孢菌粉），每份藥材63g，每份均加入10 倍量水量使其沒過藥材，每15min 取出一份藥品，過濾，測定浸入藥液的體積，計(jì)算7 份樣品的吸水率。結(jié)果見圖1。

圖1 浸泡時(shí)間趨勢圖Fig.1 Trend chart of soaking time

從圖 1 可知，75min 藥材吸水量為 60mL，自90min 起為61mL，吸水率為96.83%，且隨著時(shí)間增加吸水率不再上升，呈吸水飽和狀態(tài)，故將浸泡時(shí)間選為90min。

2.4 提取工藝正交試驗(yàn)考察

對蟲草益腎方中（不含蟲草被孢菌粉）藥材的浸泡時(shí)間單獨(dú)考察，對提取時(shí)間、加水量以及提取次數(shù)，采用正交試驗(yàn)法，根據(jù)生產(chǎn)的實(shí)際情況，選擇三個(gè)水平，采用梯度設(shè)計(jì)，在平行操作條件下按L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，將藥材的出膏率、浸出物、大黃有效成分大黃總蒽醌含量、腎茶有效成分迷迭香酸含量和黃芪有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量設(shè)為考察指標(biāo)，優(yōu)選出適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的提取工藝。

2.4.1 正交試驗(yàn)因素水平

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factor levels of orthogonal test

一個(gè)處方的中藥，第一次加完水后靜置90min，回流提取藥液、過濾殘留藥渣、冷卻、濃縮定容至200mL，備用。測定出膏率、浸出物和大黃總蒽醌、迷迭香酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

2.4.2 出膏率測定方法 9 份2.4.1 項(xiàng)下提取液各50mL，水浴加熱揮發(fā)掉水分，烘箱105 ℃干燥至恒重，稱量，按照干膏重÷50×200/用藥量×100%的公式計(jì)算出膏率。

2.4.3 浸出物測定方法[2]9 份2.4.2 項(xiàng)下干膏，研成細(xì)粉后取2g，按照2015 年版《中國藥典》醇浸出物測定方法測定蟲草益腎方浸出物含量。

2.4.4 大黃總蒽醌含量測定方法[3]

2.4.4.1 大黃總蒽醌對照溶液制備 2.1mg 1,8-二羥基蒽醌，5%NaOH-2%NH4OH 溶解定容至250mL，備用。

2.4.4.2 最佳吸收波長的確定[4]取2.4.4.1 項(xiàng)下溶液，于200～800nm 范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示在535nm處，有最大吸收，且無干擾。

2.4.4.3 大黃總蒽醌含量測定 取2.4.1 項(xiàng)下9 份提取液，每份4mL，加8% HCl 8mL，沸水浴30min，用乙醚20mL 萃取（重復(fù)兩次），合并萃取液，加混合堿萃取兩次，一次20mL，合并堿液，加混合堿定容至50mL。取上述液體2.5mL 中加混合堿液定容至25mL，535nm 波長處測定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（C=42.92A+0.311，R=0.9994）算出相應(yīng)濃度并計(jì)算出一個(gè)處方量里大黃總蒽醌含量，mg。大黃總蒽醌含量（mg）=C×25×50×200/（2.5×4×1000），結(jié)果見圖2。

2.4.5 迷迭香酸含量測定[5]

2.4.5.1 迷迭香酸對照溶液 1.2mg 迷迭香酸對照品，甲醇溶解并定容至10mL，備用。

2.4.5.2 迷迭香酸供試溶液 2.4.1 項(xiàng)下9 份提取液，每份5mL，甲醇定容至25mL，過濾，即得。

2.4.5.3 色譜條件 高效液相色譜儀:Waters1515；色譜柱：C18柱；流動(dòng)相:為甲醇-0.5% H3PO4溶液（40∶60）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：330nm，結(jié)果見圖2。

2.4.6 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法[6,7]

2.4.6.1 毛蕊異黃酮對照溶液 7.0mg 毛蕊異黃酮對照品，甲醇溶解并定容10mL，制成毛蕊異黃酮對照品提取液（700μg·mL-1），備用。

2.4.6.2 毛蕊異黃酮供試溶液 10mL 2.4.1 項(xiàng)下提取液9 份，每個(gè)樣品20mL 正丁醇萃取，重復(fù)3 次，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)状既芙獠⒍ㄈ葜?mL。

2.4.6.3 色譜條件 高效液相色譜儀:Waters 1515；色譜柱:C18柱；流動(dòng)相:為乙腈-0.2%甲酸溶液（15∶85）；流速:1.0mL·min-1；柱溫:室溫；檢測波長:260nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線（A=28377C+106054，R=0.9993），一個(gè)處方量里毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量（mg）=C×5×200/（10×1000），測定結(jié)果見圖2。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 正交試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.2 Graph of orthogonal test results

由圖2 可知，結(jié)合各正交設(shè)計(jì)表以及生產(chǎn)實(shí)際效率、成本問題與節(jié)約能源因素，最終選擇提取工藝為A2B3C2，即水提取3 次，加水量分別為蟲草益腎方（不含不含蟲草被孢菌粉）藥材總量的8、6、4 倍，提取時(shí)間分別為 90，60，30min。

2.6 濃縮工藝研究

2.6.1 供試品提取液的制備 按照正交試驗(yàn)確定的提取工藝，收集提取液，備用。

2.6.2 相對密度測定方法 取2.6.1 項(xiàng)下提取液4份，每份200mL，于0.09MPa 80℃下減壓濃縮，分別濃縮至 50，45，40，35mL，按照《中國藥典》2015 年版相對密度測定方法測定。即得。

2.6.3 濃縮程度考察結(jié)果 結(jié)果顯示，湯劑濃縮體積為50mL、相對密度1.21g·mL-1時(shí)藥液呈較稀薄的狀態(tài)，干燥時(shí)間長；濃縮體積為45～40mL、相對密度1.26～1.32g·mL-1時(shí)濃縮液比較粘稠且收集方便、易于干燥；濃縮體積為35mL、相對密度1.36g·mL-1時(shí)濃縮液呈極粘稠、難收集狀態(tài)，所以綜合考慮選定濃縮藥液的為相對密度1.26～1.32g·mL-1，此時(shí)的藥液不掛壁且無黏粘現(xiàn)象，此時(shí)可進(jìn)行下步干燥工藝。

2.6.4 常壓濃縮考察 取2.6.1 項(xiàng)下提取液3 份（每份200mL），溫度為100℃、90℃的水浴鍋上，溶液濃縮約至40mL，稱重，測相對密度。稱取清膏2.5g，蒸餾水溶解并定容至25mL，進(jìn)行考察指標(biāo)測定，結(jié)果見表2。

表2 常壓下不同溫度考察試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Test results of different temperatures under normal pressure

2.6.5 減壓濃縮考察 取2.6.1 項(xiàng)下提取液4 份（每份 200mL），在溫度 90℃下，分別以 0.06、0.07、0.08和0.09MPa 壓力條件進(jìn)行濃縮，溶液濃縮約至40mL，稱重，測相對密度。取清膏2.5g，蒸餾水溶解，定容至25mL，進(jìn)行指標(biāo)測定。

表3 減壓下不同壓力考察試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test results of different pressures under reduced pressure

2.6.6 濃縮工藝考察結(jié)論 綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，減壓和常壓濃縮時(shí)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸含量均能較有效的反映客觀水平。為考慮到節(jié)能、節(jié)時(shí)、高效等諸方面因素，綜合評價(jià)，確定濃縮工藝為:在0.08MPa、80℃條件下減壓濃縮，濃縮的相對密度1.26～1.32（80℃）。

2.7 干燥工藝研究

2.7.1 供試品制備 按照正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件，收集提取液，按照濃縮實(shí)驗(yàn)確定的最佳濃縮工藝進(jìn)行濃縮，收集清膏，備用。

2.7.2 常壓干燥考察 2.7.1 項(xiàng)下儲(chǔ)備清膏每份26g，共3 份，分別放于溫度為80、90、100℃的鼓風(fēng)干燥箱中。測定出膏率、浸出物；干燥細(xì)粉1.0g，蒸餾水定容至25mL，混勻，進(jìn)行考察指標(biāo)測定。

2.7.3 減壓干燥考察 稱取2.7.1 項(xiàng)下儲(chǔ)備清膏每份 26g，共 4 份，置于溫度為 80℃，壓力為 0.06、0.07、0.08、0.09MPa 的減壓干燥箱中，測定出膏率、浸出物；1.0g 干燥細(xì)粉，蒸餾水定容至25mL，混勻，進(jìn)行考察指標(biāo)測定。

2.7.4 干燥考察結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)表明，在常壓干燥及減壓干燥的過程中，出膏率、浸出物、毛蕊異黃酮、迷迭香酸含量均無顯著性差異，但減壓干燥工藝耗時(shí)短，濃膏干燥后的藥品呈蓬松狀，且易從容器內(nèi)轉(zhuǎn)移出，易粉碎，所以選擇減壓干燥為最優(yōu)干燥工藝條件，選擇減壓壓力（0.06～0.09）MPa，溫度為60～100℃，為適宜的工藝條件。

2.8 制劑成型工藝研究

2.8.1 賦形劑的考察 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定干膏和輔料添加比例干膏∶糊精（10∶5），干膏：可溶性淀粉（10∶5），干膏：羧甲基纖維素鈉（10∶2），干膏:蔗糖粉（10∶10）即可制成符合藥典規(guī)定的顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對賦形劑進(jìn)行吸濕性、成型性、溶化性以及休止角的考察來選擇恰當(dāng)輔料[8]。

2.8.2 干膏粉制備 按照正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件，收集提取液，按照濃縮試驗(yàn)確定的最佳濃縮工藝進(jìn)行濃縮，收集清膏，按照干燥工藝將清膏干燥后粉碎，備用。以粒度、休止角、溶化率以及吸濕率為指標(biāo)綜合評價(jià)，優(yōu)選最適宜輔料。

綜合指標(biāo)=（20/最大粒度值）×粒度值+（最小休止角值×20）/休止角值+（30/最大溶化性值）×溶化性值+（最小吸濕率值×30）/吸濕率值

2.8.3 粒度的測定 按照2015 年版《中國藥典》方法采用雙篩分法測定并計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 綜合評分結(jié)果Tab.4 Comprehensive score result table

2.8.4 休止角的測定 按照2015 年版《中國藥典》方法采用固定漏斗法測定并計(jì)算，結(jié)果見表4。

2.8.5 顆粒溶化率的測定 2.8.2 項(xiàng)下4 份樣品各10g，放入燒杯中，加熱水200mL，攪拌，所得溶液離心管中 3000r·min-1離心 15min，留下層，烘箱 80℃烘干至恒重，稱量，溶化率(%)=殘?jiān)亓?未溶前顆粒重量×100%。分值：(20/最大溶化性值)×溶化性值，結(jié)果見表4。

2.8.6 吸濕率的測定 2.8.2 項(xiàng)下四份樣品顆粒各2g，按照2015 年版《中國藥典》進(jìn)行吸濕率測定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

2.8.7 綜合評分 綜合評分結(jié)果表明糊精的分值最高為98.84，其次是蔗糖粉94.22，試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇干浸膏粉與糊精（10∶5）混合制成的顆粒和浸膏粉與蔗糖粉（10∶10）兩種賦形劑制成的顆粒皆容易制粒，穩(wěn)定性好，溶化率高且流動(dòng)性較好。故篩選出來的最優(yōu)輔料為糊精，其次為蔗糖粉，若蔗糖作為賦形劑，無需額外增加用量口感即適宜，能夠接受，所以顆粒劑在以蔗糖作為賦形劑的情況下無需添加矯味劑。

3 成型工藝確立

蟲草益腎顆粒劑一個(gè)處方的生藥量為63g，出膏率按33%計(jì)算，可得干膏細(xì)粉21g，加入3g 蟲草被孢菌粉，為24g，加入蔗糖粉量比例為1∶1，即48g，分3 次服用，則每次用量約為16g。按1000g 計(jì)算，蟲草益腎顆粒劑一個(gè)處方生藥量為1260g 加入60g蟲草被孢菌粉，制成顆粒劑1000g，規(guī)格16g·袋-1。

4 制法

蟲草益腎方（除蟲草被孢菌粉）提取3 次，首次加8 倍量水，靜置90min 后，回流提取90min，留存濾液，藥渣第二次加6 倍量水，回流提取60min，留存二次濾液，濾渣第三次加4 倍量水，回流煎煮30min，合并提取液，濾過，濃縮至相對密度為1.26～1.32 的濃膏，充分干燥后粉碎，加蟲草被孢菌粉，混勻，加輔料，制軟材，干燥，整粒，包裝。

5 結(jié)論

藥液的濃縮是制備顆粒劑的關(guān)鍵工藝步驟，選用適當(dāng)?shù)臐饪s方式既可以保證藥品的質(zhì)量穩(wěn)定，又能夠提高藥品的生產(chǎn)效率以及降低藥品的生產(chǎn)成本。在生產(chǎn)中中藥制劑的濃縮方式常采用的有常壓與減壓濃縮兩種[9]。其中常壓濃縮具有生產(chǎn)成本較低、生產(chǎn)設(shè)備簡單的優(yōu)點(diǎn)，但又具有濃縮時(shí)程長、所需溫度高的缺點(diǎn)，相比之下減壓濃縮的速度快，能夠較好的保留中草藥的有效成份，且所需溫度低，是現(xiàn)在生產(chǎn)中較為普及的濃縮藥液的方式。

顆粒劑的制粒是其成型工藝的關(guān)鍵，常用的顆粒劑的制備方法有干法制粒和濕法制粒[10]。濕法制粒對于出膏率較低的中藥顆粒劑制備較為適用，但缺點(diǎn)是所需輔料量較大，而干法制粒適用于出膏量較大的中藥顆粒劑的制備，該方法在減少輔料用量的同時(shí)還可以減少臨床用藥劑量。通過蟲草益腎方的出膏率實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知本方出膏率較大，因而采用干法制粒。本實(shí)驗(yàn)對設(shè)計(jì)的考察指標(biāo)采用了單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察法，優(yōu)選最佳的提取工藝；通過濃縮干燥試驗(yàn)制定出適宜的濃縮、干燥工藝條件；經(jīng)過對不同輔料制成顆粒后的綜合考察，確定了以蔗糖粉為輔料及其最佳比例，為蟲草益腎方的進(jìn)一步研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。