杜紅飛 龐雪利 陽燕 周曉萍 許穎
白內(nèi)障是我國乃至全世界常見的高致盲性眼病[1-2]。眼部受損、老齡化、糖尿病、紫外線照射、藥物及其他眼部疾病等多種因素皆可導(dǎo)致晶狀體蛋白變性、混濁,增加白內(nèi)障的發(fā)病率[3]。近年來,由于人口老齡化的增加,老年性白內(nèi)障發(fā)生率逐年升高,極大地降低了該病患者的生活質(zhì)量。因此,我們迫切需要探究老年性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的病理機制,尋找更有效生物標(biāo)志物,早期檢測和診斷白內(nèi)障,從而減輕白內(nèi)障的危害。
環(huán)狀 RNA(circular RNAs,circRNAs)是一種新類型的非編碼RNA,由外顯子或內(nèi)含子反向剪接構(gòu)成[4-5]。目前研究發(fā)現(xiàn),circRNAs廣泛存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)中,能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達。與傳統(tǒng)線型RNA不同,circRNAs沒有5’端帽子和 3’末端poly(A)尾巴結(jié)構(gòu),不易被核酸外切酶降解,因此比線性RNA更具穩(wěn)定性和高度保守性,可作為生物標(biāo)志物和潛在臨床治療靶標(biāo)[6-7]。另外大量研究證實,circRNAs的異常與人類疾病具有密切的關(guān)系,如癌癥[8-9]、心血管疾病[10]和阿爾茨海默病[11]等。然而,對于circRNAs在老年性白內(nèi)障中的研究目前尚未見報道。因此,本研究擬采用circRNAs芯片技術(shù)檢測老年性白內(nèi)障患者外周血中circRNAs表達,研究其circRNAs表達譜特征,為老年性白內(nèi)障的預(yù)防、早期診斷、靶向藥物的開發(fā)及臨床治療進一步提供理論基礎(chǔ)。
1.1 一般資料選取2019年1月1日至2019年3月31日成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院初次確診為皮質(zhì)型老年性白內(nèi)障且不合并其他任何疾病的3例患者作為試驗組,依據(jù)晶狀體混濁分類系統(tǒng)LOCSII,試驗組晶狀體皮質(zhì)混濁為C3,晶狀體核透明,均為男性,皆在臨床干預(yù)治療前靜脈抽取患者EDTA抗凝的全血標(biāo)本。另選取同時間段于本院體檢部體檢正常的3名健康者作為對照組,均為男性,抽取患者EDTA抗凝的外周血標(biāo)本,全血標(biāo)本均凍存于-80 ℃冰箱保存。所有研究對象均排除其他眼科疾病和重要器官系統(tǒng)疾病,如糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病、腫瘤等,且研究對象均知情并同意參加本項試驗。該研究過程經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。
1.2 主要試劑和材料Trizol試劑 (Invitrogen life technologies,美國),熒光標(biāo)記cRNA的Arraystar Super RNA Labeling試劑盒、circRNAs芯片(Arraystar,美國)。
1.3 方法
1.3.1 提取樣本總RNA用于circRNAs芯片檢測的試驗組和對照組樣本分別由3例老年性白內(nèi)障患者全血RNA混合和3名健康體檢者全血RNA樣本混合組成,每個樣本1 mL,每組3個樣本,各提取核酸后按照11的體積混合,采用Trizol法分別提取老年性白內(nèi)障患者和健康體檢者外周血的總RNA,利用NanoDrop ND-1000及瓊脂糖凝膠電泳法評價總RNA的濃度、完整性及純度。
1.3.2 circRNAs微陣列芯片利用NanoDrop ND-1000對提取的總RNA進行濃度和純度檢測。采用Arraystar標(biāo)準(zhǔn)方案制備樣本并進行芯片雜交:先用Rnase R(Epicentre,Inc.美國)消化總RNA用以去除線性RNA并富集circRNAs,然后采用隨機引物的方法(Arraystar Super RNA Labeling Kit;Arraystar,美國)擴增富集的circRNAs并轉(zhuǎn)錄成帶熒光標(biāo)記的cRNA。再利用RNeasy Mini Kit(Qiagen,德國)對cRNA進行純化并使用NanoDrop ND-1000檢測cRNA濃度和活性。最后將標(biāo)記熒光的cRNA與Arraystar Human circRNA Array V2 (Arraystar,美國)雜交。Agilent清洗液試劑盒清洗芯片后用Agilent G2505C掃描。
1.3.3 circRNAs芯片數(shù)據(jù)采集與分析將掃描獲得的芯片圖,用Agilent Feature Extraction(11.0.1.1版)進行解析獲得原始數(shù)據(jù),然后利用R語言中的limma對數(shù)據(jù)進行歸一化和后續(xù)的數(shù)據(jù)處理。計算每個circRNAs分子在組間的fold change值,并將|fold change|≥ 2.0的circRNAs認(rèn)為在組間有明顯差異。明顯差異的circRNAs繪制成散點圖,并利用Arraystar基于TargetScan和miRanda數(shù)據(jù)庫獨立開發(fā)的微小RNA(miRNA)靶向結(jié)合位點預(yù)測軟件預(yù)測circRNAs可能吸附的miRNA。針對miRNA對應(yīng)的靶基因做GO與KEGG分析,查看富集的生物學(xué)過程。
2.1 RNA的質(zhì)量試驗組和對照組對應(yīng)樣本的光密度比值(D260/D280)均大于1.8,在2.0左右(1.8~2.1)(見表1)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,兩組各樣本RNA的5 S、18 S和28 S電泳條帶清晰,可進一步進行circRNAs芯片檢測(見圖1)。
表1 試驗組和對照組總RNA濃度和質(zhì)量
圖1 總RNA凝膠電泳圖 C1~C3為試驗組,N1~N3為對照組
2.2 差異表達circRNAs的散點圖利用生物信息學(xué)工具,將試驗組和對照組分析獲得的差異circRNAs繪制成散點圖(見圖2)。結(jié)果顯示,與對照組比較,試驗組外周血中異常表達的circRNAs共有242個(fold change絕對值≥2.0),其中上調(diào)的有100個(fold change≥2.0),差異倍數(shù)>3的有9個;下調(diào)的有142個 (fold change≤-2.0),差異倍數(shù)>3的有13個(見表2與表3)。
圖2 差異circRNAs表達譜圖上方(fold change≥2.0)示上調(diào)的circRNAs,下方(fold change ≤-2.0)示下調(diào)的circRNAs
表2 試驗組相對于對照組表達上調(diào)的circRNAs
2.3 差異表達的circRNAs與miRNA結(jié)合位點預(yù)測利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan和miRanda預(yù)測每個差異circRNAs的5個miRNA結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_100049與白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)miR-15a-3p 有結(jié)合位點;hsa_circRNA_102534、hsa_circRNA_101911和hsa_circRNA_101892與白內(nèi)障晶狀體衰老相關(guān)miR-34a-5p有結(jié)合位點,具有miRNA海綿作用(見表4)。
2.4 差異circRNAs的功能分析對篩選出的差異circRNAs所涉及的基因進行GO和KEGG分析。GO分析發(fā)現(xiàn),差異表達在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程、發(fā)育及RNA轉(zhuǎn)錄等方面有功能富集表現(xiàn)(見圖3A、3B)。同時,KEGG分析顯示,差異circRNAs下游主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,Akt)等信號通路(見圖3C、3D)。
表3 試驗組相對于對照組表達下調(diào)的circRNAs
表4 差異表達的circRNAs與下游靶向吸附 miRNA的預(yù)測結(jié)果
圖3 上調(diào)與下調(diào)差異circRNAs的GO富集分析及KEGG富集分析A:上調(diào)差異circRNAs的GO富集分析;B:下調(diào)差異circRNAs的GO富集分析;C:上調(diào)差異circRNAs的KEGG富集分析;D:下調(diào)差異circRNAs的KEGG富集分析
circRNAs首次在植物病毒中被發(fā)現(xiàn),然后大量的研究證實circRNAs也存在于人體組織細(xì)胞內(nèi)。隨著人們對circRNAs的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究,發(fā)現(xiàn)circRNAs序列表達具有進化保守性、組織及發(fā)育階段的特異性[12],且可通過多種方式參與蛋白質(zhì)的翻譯,調(diào)控基因表達與線性RNA的生成,如競爭內(nèi)源RNA能結(jié)合miRNA調(diào)節(jié)miRNA的表達水平;海綿作用吸附miRNA能解除miRNA對一些mRNA的去阻遏[13];同時,circRNAs還可以通過與其他蛋白或因子相互結(jié)合形成復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控作用[14]。另外,近年來大量研究證實,circRNAs在人類多種疾病如糖尿病[15]、動脈粥樣硬化[10]等的發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。Lukiw等[11]發(fā)現(xiàn),ciRS-7在阿爾茨海默病患者的海馬區(qū)表達下調(diào),導(dǎo)致ciRS-7的海綿效應(yīng)缺失,下游的miR-7表達上調(diào)及其靶mRNA的表達變化影響了該疾病的進展。同時,Jeck等[16]揭示circMbl與肌強直性營養(yǎng)不良的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān);Burd等[17]證實動脈硬化性疾病與circRNA ANRIL的表達存在密切相關(guān)性;Li等[18]發(fā)現(xiàn) Cir-ITCH可通過吸附miR-7、miR-17、miR-124從而上調(diào)ITCH抑制Wnt信號通路,在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用;在結(jié)直腸癌中存在circRNAs的表達與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。進一步研究揭示,結(jié)腸癌患者與健康人群的血清外泌體中存在circRNAs的表達差異,可作為結(jié)腸癌的血清標(biāo)志物等[19]。由此可見,circRNAs可能成為未來多種疾病診斷的新型標(biāo)志物或治療靶點。
然而,目前circRNAs在老年性白內(nèi)障患者外周血中的表達研究尚處于空白。因此,本研究首先運用circRNAs芯片技術(shù)檢測老年性白內(nèi)障和健康體檢者外周血circRNAs的表達譜。結(jié)果顯示,白內(nèi)障患者外周血中存在差異表達的circRNAs共有242個,其中上調(diào)的100個,差異倍數(shù)>3的9個;下調(diào)的142個,差異倍數(shù)>3的13個,這提示circRNAs可能與老年性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。進一步運用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異circRNAs表達主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程、發(fā)育及RNA轉(zhuǎn)錄等過程。與此同時,利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測了circRNAs的5個靶向 miRNA結(jié)合位點,并查閱相關(guān)文獻,發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p與白內(nèi)障晶狀體衰老相關(guān),miR-15a-3p與白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān),而hsa_circRNA_100049、hsa_circRNA_102534、hsa_circRNA_101911以及hsa_circRNA_101892與這些miRNA存在結(jié)合位點,據(jù)此推測,這些circRNAs可能通過靶向吸附miR-34a-5p、miR-15a-3p調(diào)控老年性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。以上研究結(jié)果將在后期的臨床標(biāo)本及細(xì)胞水平的實驗中進行驗證,以期為老年性白內(nèi)障的早期預(yù)測、診斷和治療提供更多數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
總之,上述circRNAs在老年性白內(nèi)障中的表達差異揭示了circRNAs可能與老年性白內(nèi)障的發(fā)病具有密切相關(guān)性。差異表達的circRNAs有待進一步在大樣本中得到驗證,相關(guān)的分子作用機制需深入探究。以上研究結(jié)果為進一步探究老年性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展提供了試驗基礎(chǔ),為未來circRNA應(yīng)用于老年性白內(nèi)障臨床早期預(yù)測、診斷和靶向治療的研究提供了理論依據(jù)。另外,老年性白內(nèi)障的發(fā)病存在復(fù)雜的分子調(diào)控機制,我們后期將重點研究差異circRNAs表達與miRNA相關(guān)的蛋白質(zhì)或基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后,由于該研究僅做了1次3組混樣的芯片檢測,數(shù)據(jù)較少,但有文獻研究表明,混樣實驗結(jié)果對于疾病研究具有一定的價值,能夠減少單一樣品對于整組樣品造成的數(shù)據(jù)偏差風(fēng)險,且更加突出所有樣本的共有數(shù)據(jù)[20]。