兔眼超聲乳化吸出術后非手術眼房水及血清中TNF-α、IL-1β表達變化與該眼角膜知覺敏感度變化之間的關系△

楊瑞波 于笛 牟芃玥 劉雪梅 趙少貞

目前，白內障仍是我國首位致盲眼病，在所有致盲眼病中約占56.7%[1]。白內障患者多為雙眼患病,第一眼白內障手術后,由于雙眼視力及屈光狀態(tài)不一致，患者雙眼視功能會受到影響[2],故越來越多患者短期內要求行第二眼白內障手術。但是,臨床中部分短期內行第二眼白內障手術的患者常出現(xiàn)術中眼部疼痛較第一眼加重的現(xiàn)象[2]，導致患者配合能力下降[3]，如眼球運動頻繁，后房眼壓升高，甚至出現(xiàn)心率加快、血壓升高、情緒緊張等連帶反應，以上情況增加了手術難度及風險，手術并發(fā)癥發(fā)生率(如后囊膜破裂、眼壓升高、眼底出血等)也會隨之升高，導致患者對第二眼手術的滿意度下降。

當前，臨床上對于第一眼和第二眼白內障手術眼部疼痛感知差異的研究相對較少，有關第二眼白內障手術痛覺敏感性增強(痛覺過敏)的研究主要限于臨床觀察水平，缺乏對相關機制的基礎研究。本研究通過檢測兔第一眼晶狀體超聲乳化吸出術后不同時期，非手術眼房水及血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的表達及該眼角膜知覺敏感度，并與術前基線值相比，探討非手術眼房水及血清中TNF-α及IL-1β的變化與該眼角膜知覺敏感度變化之間的關系，進而探討第一眼晶狀體超聲乳化吸出術后，第二眼痛覺過敏的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料選取健康成年新西蘭大白兔40只作為實驗對象，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，實驗前雙眼經裂隙燈和眼底檢查均正常。常規(guī)飼養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將大白兔分為實驗組與空白對照組，實驗組25只，空白對照組15只。實驗組手術眼與空白對照組第一眼采用隨機數(shù)字編號入組，實驗組一眼行晶狀體超聲乳化吸出術，根據術后取材時間分為術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d共5組，每組5只動物?？瞻讓φ战M按照對應取材時間也分為5組，每組3只動物。實驗動物的使用均遵循實驗動物醫(yī)學倫理條例及國家實驗動物管理保護條例。

1.2 主要試劑及儀器兔TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(中國Bio-Swamp公司)，血液樣品總RNA小計量提取試劑盒(中國Magen公司)，手術顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)，超聲乳化儀(美國Alcon公司)。

1.3 方法

1.3.1 手術方法術前3 d每只兔雙眼滴5 g·L-1左氧氟沙星(日本參天制藥有限公司)，每天4次，超聲乳化吸出術由同一經驗豐富的術者完成。術前30 min用復方托吡卡胺(沈陽興齊制藥有限公司)散瞳3 次，術前10 min用表面麻醉劑丙美卡因(南京瑞年百思特制藥有限公司)滴眼2次，速眠新Ⅱ注射液(敦化市圣達動物藥品有限公司)肌肉注射麻醉(0.3 mL·kg-1)，常規(guī)消毒手術野。鋪無菌洞巾，開瞼器開瞼，聚維酮碘(上海利康消毒高科技有限公司)滴眼，生理鹽水沖洗結膜囊。

超聲乳化吸出術：實驗組術眼于房水抽取后自穿刺口向前房注入平衡鹽溶液，恢復前房深度。在上方2.2 mm處行透明角膜切口，前房注入黏彈劑，環(huán)形撕囊直徑5 mm，水分離，超聲乳化吸出軟核，注吸皮質，角膜切口水密。手術結束后，術眼涂妥布霉素地塞米松眼膏(美國Alcon公司)，清醒后放入兔房正常喂養(yǎng)。術后用藥：術后1周內，術眼滴妥布霉素地塞米松滴眼液，每天4次，此后逐周遞減1次，4周后停用。

1.3.2 觀察并記錄實驗動物雙眼的結膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應情況于術前及術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，在裂隙燈下分別觀察并記錄兩組實驗動物雙眼的結膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應情況，兔眼結膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應分級標準見表1。

表1 兔眼結膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應分級標準

1.3.3 各組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平檢測采用實時定量PCR檢測兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平。于術前及術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，分別取實驗組與空白對照組兔肢體血液5 mL，離心后取血清，按照試劑盒說明書提取血清總RNA，Nanodrop 2000分光光度計檢測RNA的純度及濃度。將總RNA逆轉錄后，在實時定量PCR儀上進行PCR擴增，使用GAPDH作為內參照。實時定量PCR所使用引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成,其中TNF-α引物序列：上游為5’-ATGAGCACTGAAAGCATGA-3’，下游為5’- GAGGGCTGATTAGAG-3’；IL-1β引物序列:上游為5’-GTCTTCCTAAAGCAAGCC-3’，下游為 5’- GGGGTGTCACAATCTGT-3’；GAPDH引物序列:上游為 5’- GATGCTGGTGCCGAGTAC-3’，下游為5’- GCTGAGATGATGACCCTTTT-3’。反應條件:95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s,72 ℃延伸 2 min,總共 35 個循環(huán)。用2-ΔΔCt法定量目的基因TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平。

1.3.4 兔房水TNF-α、IL-1β蛋白濃度檢測術前由同一實驗者取實驗組動物術眼及空白對照組動物第一眼房水。術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，取實驗組非手術眼及空白對照組第二眼房水。取房水前用聚維酮碘消毒，丙美卡因滴眼液表面麻醉，用30 G針頭滅菌注射器，自顳上角膜緣內0.5 mm穿刺進入前房抽取房水0.1 ～0.2 mL。用ELISA法檢測房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度。依序測量450 nm波長處光密度(D)值，以TNF-α和IL-1β濃度為橫坐標，D值為縱坐標，繪制標準曲線，根據D值由標準曲線查出房水中TNF-α和IL-1β蛋白相應濃度。實驗步驟嚴格按照說明書操作。

1.3.5 角膜知覺敏感度檢測于術前及術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，由同一實驗者使用Cochet-Bonnet 角膜知覺計(法國Luneau Ophthalmologie公司)測量實驗組非手術眼與空白對照組第二眼角膜知覺。角膜知覺計的尼龍纖維長度為0～60 mm，可調節(jié)，直徑為 0.12 mm。尼龍纖維長度與其施加于角膜的壓力呈負相關，即長度越長，對角膜的壓力越小。測量前，將兔置于安靜室內環(huán)境，受檢兔清醒，精神狀態(tài)良好。測量從60 mm開始，測量時將角膜知覺計的尼龍絲垂直于兔角膜中央表面，輕施壓力，每次遞減5 mm，直至出現(xiàn)被檢測眼眨眼及躲避行為作為兔眼角膜知覺陽性反應，同一長度測量3次，每次測量間隔30 min，如果3次檢測中出現(xiàn)2次陽性反應視為陽性結果，引起該陽性結果的尼龍纖維長度即為角膜知覺敏感度。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示。利用單因素重復測量ANOVA及兩兩比較兩組內各取材時間點房水、血清中細胞因子及角膜知覺敏感度差異。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 術后眼前節(jié)炎癥反應情況實驗組25眼手術眼的結膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應級別，在術后1 d均為Ⅱ級，術后3 d、7 d為Ι～Ⅱ級，術后14 d降至Ι級，術后21 d恢復至0級。實驗組非手術眼與空白對照組雙眼在不同時間點，結膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應級別均為0級。

2.2 兩組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平的變化以兩組兔術前血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平為基線值。實驗組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平在手術前后不同時間點差異均有統(tǒng)計學意義(F=272.800、193.530，均為P<0.05)。術后1 d、3 d、7 d、14 d，實驗組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平均較基線值升高，術后7 d達高峰(TNF-α mRNA相對表達量為14.95±0.89，IL-1β mRNA相對表達量為7.56±0.46)，之后逐漸下降，術后21 d降至術前水平。實驗組各相鄰取材時間點兩兩比較，血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。空白對照組各取材時間點，兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達水平在不同時間點與基線值相比，差異均無統(tǒng)計學意義(F=1.612、0.626，均為P>0.05)(見圖1)。

圖1 術前和術后不同時間點兩組兔血清TNF-α mRNA及IL-1β mRNA表達水平的變化 相同時間點兩組相比,*P<0.05

2.3 兩組兔房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度變化以實驗組術前手術眼、空白對照組第一眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度為基線值。實驗組非手術眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度在不同時間點差異均有統(tǒng)計學意義(F=184.200、82.900，均為P<0.05)。術后1 d、3 d、7 d、14 d，非手術眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度均較基線值升高，其中峰值出現(xiàn)于術后7 d[TNF-α蛋白濃度為(162.34±5.71) ng·L-1，IL-1β蛋白濃度為(16.68±0.74)ng·L-1]，之后逐漸下降，術后21 d降至術前水平。實驗組相鄰取材時間點兩兩比較，非手術眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M第二眼不同取材時間點房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度與基線值相比，差異均無統(tǒng)計學意義(F=1.140、0.820，均為P>0.05)(見圖2)。

2.4 角膜知覺敏感度變化以實驗組術前非手術眼及空白對照組第二眼角膜知覺敏感度為基線值。實驗組非手術眼角膜知覺敏感度在不同時間點差異有統(tǒng)計學意義(F=244.910，P<0.05)；術后1 d、3 d、7 d、14 d，非手術眼角膜知覺敏感度較基線值升高，于術后7 d角膜知覺敏感度最高，之后角膜知覺敏感度逐漸下降，術后21 d基本恢復至基線水平。實驗組非手術眼相鄰時間點兩兩比較，角膜知覺敏感度差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。空白對照組第二眼不同時間點角膜知覺敏感度比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.344，P>0.05)(見表2)。

圖2 實驗組非手術眼與空白對照組第二眼不同時間點房水TNF-α及IL-1β濃度的變化 相同時間點兩組相比,*P<0.05

表2 兩組不同時間點角膜知覺敏感度變化

3 討論

白內障超聲乳化吸出術是目前治療白內障的最有效方法[4]。隨著小切口、微切口手術技術的提高及人工晶狀體設計方案的不斷完善,白內障超聲乳化吸出術后患者視覺質量已得到極大提升[5]。然而，關于第一眼白內障術后，第二眼痛覺敏感性增強(痛覺過敏)這一常見問題并未受到臨床廣泛重視。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，雙眼白內障患者對首次和第二次白內障手術的主觀感覺評估存在差異，第一眼白內障手術后，對側眼可能存在交感性葡萄膜炎，導致第二眼手術更加疼痛。另有文獻報道[8-9]，如果患者在第一眼手術過程中存在對光敏感、術前精神壓力大及術后畏光等癥狀，會導致心理負擔加重，進而影響他們第二眼術中對疼痛的感知。

國際疼痛研究學會神經病理性疼痛特別興趣小組將神經病理性疼痛界定為由軀體感覺神經系統(tǒng)的損傷或疾病所導致的疼痛[10]。近年來，隨著分子生物學的研究進展，學者們發(fā)現(xiàn)細胞因子 TNF-α、IL-1β除可以誘導白細胞活化、趨化、誘發(fā)炎癥反應外[11]，在神經系統(tǒng)中還可以作為神經調質增強感覺神經元敏感性，導致神經病理性疼痛(包括痛覺過敏)[12]。正常情況下,TNF-α、IL-1β在中樞神經系統(tǒng)與外周神經系統(tǒng)中的表達很低，神經受損傷后，該細胞因子表達上調，并在神經系統(tǒng)中呈雙向轉運[13]。當外周神經損傷后，細胞因子逆行轉運至中樞，參與中樞部位細胞因子的激活，這是神經病理性疼痛發(fā)病機制之一[14]。

Zong等[15]對大鼠坐骨神經慢性縮窄模型(chronic constriction injury model，CCI)進行研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓中，TNF-α mRNA在術后表達升高，術后7 d達到高峰，術后14 d已經開始下降，術后21 d恢復至基礎水平。此外，CCI大鼠機械縮足反射閾值降低，以術后7 d時最低，之后緩慢回升，術后21 d仍未升至術前水平。Okamoto等[16]測定CCI大鼠坐骨神經中TNF-α mRNA發(fā)現(xiàn)，術后14 d TNF-α mRNA表達明顯升高，IL-1β mRNA 于術后7 d表達上調，證實其可能參與傷害性信息的傳遞過程，致敏中樞神經元。Laughlin等[17]研究經腹腔內注射強啡肽誘發(fā)的痛覺過敏大鼠模型發(fā)現(xiàn)，鞘內應用IL-1β拮抗劑可有效阻止痛覺過敏反應的發(fā)生。以上研究結果均證實，在神經系統(tǒng)中，TNF-α、IL-1β可以作為神經調質增強感覺神經元敏感性，導致痛覺過敏。

Fiore等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當眼睛受到創(chuàng)傷(包括術源性創(chuàng)傷)如白內障摘出術后，創(chuàng)傷眼房水中炎癥因子(包括TNF-α、IL-1β)的含量顯著增加。TNF-α是將特定炎癥與炎癥反應聯(lián)系起來的關鍵因素[19]，可通過刺激巨噬細胞增加IL-1β分泌。 TNF-α的作用表現(xiàn)出時間和劑量依賴性，其含量可以反映炎癥的嚴重程度。IL-1β生物學效應與TNF-α相似，可引起炎癥并誘導炎癥反應[20]，誘導TNF-α表達，刺激免疫細胞和基質細胞產生IL-1β，形成惡性循環(huán)并加速炎癥反應[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組在第一眼術后1 d、3 d、7 d、14 d，TNF-α、 IL-1β在非手術眼房水及血清中表達均上調，說明手術創(chuàng)傷不僅直接導致術眼的眼內炎癥反應，同時，還可導致非創(chuàng)傷眼房水及血清中炎癥因子表達上調。

支配眼部感覺的神經是三叉神經眼支。角膜是三叉神經眼支末梢神經分布最為密集的部位，對外界傷害性刺激的敏感性最高。由于在動物實驗中，痛覺這一主觀感受到目前為止仍無法通過動物表述等方法來直接評價，因此，本研究參考大鼠CCI原理，即通過機械刺激觀察大鼠縮足反射來評價其疼痛閾值改變，采用角膜知覺計檢測成年兔角膜接受機械刺激后出現(xiàn)眨眼及躲避等行為學表現(xiàn)，獲得角膜知覺敏感度，分析其變化規(guī)律，進而間接評價眼部痛覺敏感度變化。本研究發(fā)現(xiàn)，進行第一眼手術后1～14 d內，兔非手術眼房水中與痛覺過敏相關的TNF-α與IL-1β表達都有明顯升高，尤其在術后7 d達到峰值，并且同一炎癥因子在血清與房水中的變化趨勢呈平行關系。同時，非手術眼在第一眼術后14 d內，其角膜知覺敏感度也較手術前增高，這一變化與TNF-α、IL-1β表達上調存在時程相關性。本研究結果提示我們，導致非手術眼角膜知覺敏感度提高的原因，可能與第一眼手術創(chuàng)傷引起血清及對側眼房水TNF-α與IL-1β表達上調，繼而造成該眼三叉神經感覺支敏感化有關，而三叉神經感覺支敏感化則可進一步導致眼部痛覺過敏。因此，本研究推測患者在第一眼白內障術后，第二眼痛覺敏感性增強，并不只是一個簡單的精神心理反應，其中的病理生理學機制可能更為復雜。

本研究結果顯示實驗兔在第一眼術后2周內，其非手術眼角膜知覺敏感度提高，這對在臨床中選擇更合適的第二眼手術時機有一定參考意義。然而，有關血清及房水TNF-α與IL-1β表達上調與角膜知覺敏感度變化間的調控通路，及角膜知覺敏感度變化與痛覺過敏之間的內在聯(lián)系，還需進一步深入研究加以驗證。