崔錚 靖鵬舉 朱冬梅 王媛

多種眼科疾病與視網(wǎng)膜炎癥相關(guān)，如葡萄膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變及年齡相關(guān)性黃斑變性等[1-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通過(guò)激活白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)炎癥信號(hào)通路等導(dǎo)致炎癥因子釋放，誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)可引起多種化學(xué)介質(zhì)、細(xì)胞因子等分泌，導(dǎo)致視力不同程度損傷[4-6]。地塞米松(dexamethasone，Dex)是一種人工合成的皮質(zhì)類(lèi)固醇，可有效減輕和防止組織炎癥反應(yīng)，減輕炎癥表現(xiàn)。有研究報(bào)道，Dex可減輕LPS內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠葡萄膜炎癥反應(yīng)[7-8]，但關(guān)于Dex對(duì)LPS誘導(dǎo)RPE細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3)屬于NOD樣受體家族中一種重要炎性小體，可通過(guò)激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)，在固有免疫及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病有關(guān)[9-11]。因此，本研究擬探究Dex對(duì)LPS誘導(dǎo)RPE細(xì)胞ARPE-19炎癥損傷的作用，及其對(duì)NLRP3/Caspase-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料ARPE-19細(xì)胞(貨號(hào)：CC-Y1051)購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)； Dex(HPLC≥98%，貨號(hào)：D8040-100 mg)、LPS(貨號(hào)：L8880)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM/F-12 培養(yǎng)基(貨號(hào)：12634010)、胎牛血清(貨號(hào)：10099141)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號(hào)：6210A)、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(貨號(hào)：638314)、TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(貨號(hào)：RR820A)均購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；蛋白抽提試劑盒(批號(hào)：P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0010S)均購(gòu)自上海碧云天有限公司；MTT試劑盒(貨號(hào)：V13154)、人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α) ELISA試劑盒(貨號(hào)：BMS223HS)、人IL-1β試劑盒(貨號(hào)：BMS213HS)、人IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)：BMS213HS)、兔源NLRP3抗體(貨號(hào)：PA5-20838)、Caspase-1(貨號(hào)：MA5-32137)、GAPDH抗體(貨號(hào)：TAB1001)、羊抗兔IgG(貨號(hào)：A32731)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。MODEL550型酶標(biāo)儀、7300 RT-qPCR儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇ARPE-19細(xì)胞后，于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、10 g·L-1青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)基，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)分組將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)ARPE-19細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后以每孔5000個(gè)接種于96孔板，每孔添加100 μL培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合至85%～90%時(shí)更換為無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24 h，隨機(jī)分組：無(wú)任何處理的ARPE-19細(xì)胞為正常對(duì)照(normal control，NC)組；5 mg·L-1LPS刺激24 h的ARPE-19細(xì)胞為L(zhǎng)PS組；0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1、0.40 mol·L-1、0.80 mol·L-1Dex分別預(yù)處理2 h后，5 mg·L-1LPS刺激24 h的ARPE-19細(xì)胞為不同濃度Dex+LPS組。各組均繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，采用MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞存活率=(D處理組/D空白組)×100%。

篩選出Dex的最佳作用濃度和時(shí)間后，確定最終分組：NC組、Dex組(0.20 mol·L-1Dex處理 ARPE-19細(xì)胞24 h)、LPS組、Dex+ LPS組(0.20 mol·L-1Dex預(yù)處理2 h后，5 mg·L-1LPS處理ARPE-19細(xì)胞24 h)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)ARPE-19細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以每孔5×106個(gè)接種于6孔細(xì)胞板，分組處理后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)收集各組細(xì)胞，添加Trizol試劑提取總RNA，純度及濃度檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用RT-qPCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件設(shè)置：95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s;40個(gè)循環(huán),添加溶解曲線(xiàn)。TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 ELLSA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平ELLSA法檢測(cè)各組ARPE-19細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 Western blot檢測(cè)NLRP3、Caspase-1蛋白水平提取各組ARPE-19細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)562 nm處樣品蛋白含量。取60 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜，50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉120 min，PBST沖洗3次，每次20 min，分別添加一抗NLRP3抗體(11000)、Caspase-1抗體(11000)、GAPDH抗體 (1500)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST 緩沖液洗3次，每次 20 min，用適量含20 g·L-1脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(15000)室溫孵育1 h后，洗膜，顯色，曝片拍照，應(yīng)用Image J圖像分析軟件分析各蛋白條帶灰度值，以靶蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶比值為靶蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白水平均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA 檢驗(yàn))，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Dex、LPS對(duì)ARPE-19細(xì)胞活性的影響同一時(shí)間點(diǎn)，與NC組比較，LPS組ARPE-19細(xì)胞存活率均顯著降低(均為P<0.05)；與LPS組比較，不同濃度Dex+LPS組ARPE-19細(xì)胞存活率均顯著增加(均為P<0.05)。同一作用時(shí)間，隨著Dex濃度增加，細(xì)胞存活率呈先升高后下降的趨勢(shì)；同一處理濃度，24 h、48 h、72 h細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。其中0.20 mol·L-1Dex作用LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞24 h、48 h時(shí)細(xì)胞存活率均接近NC組，綜合考慮后選用0.20 mol·L-1Dex作用24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表2)。

表2 各組ARPE-19細(xì)胞存活率

2.2 Dex對(duì)LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平的影響NC組與Dex組間TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與NC組、Dex組比較，LPS組、Dex+LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且Dex+LPS組各炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于LPS組(均為P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組ARPE-19細(xì)胞各炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 Dex對(duì)LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達(dá)水平的影響NC組與Dex組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與NC組、Dex組比較，LSP組、Dex+LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且Dex+LPS組各蛋白表達(dá)水平均顯著低于LPS組(均為P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 各組ARPE-19細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平

2.4 Dex對(duì)LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中NLRP3/Caspase-1通路的影響NC組與Dex組NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與NC組、Dex組比較，LPS組、Dex+LPS組NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且Dex+LPS組NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白水平均顯著低于LPS組(均為P<0.05)(見(jiàn)圖1、表5)。

圖1 Western blot檢測(cè)各組ARPE-19 細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平

表5 各組ARPE-19 細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討論

RPE細(xì)胞在視覺(jué)形成及維持過(guò)程中起非常關(guān)鍵的作用，而炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致RPE細(xì)胞炎癥損傷，與多種眼科疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，可引起不同程度視力受損[12-14]。本研究采用LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與正常ARPE-19細(xì)胞比較，LPS組ARPE-19細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，在病理狀態(tài)下水平上升，有抗感染、抗炎性介質(zhì)作用；而IL-1β、IL-6均為重要促炎因子，提示LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞炎癥損傷成功。本研究還發(fā)現(xiàn)，與LPS組比較，Dex+LPS組ARPE-19細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低。Dex是一種糖皮質(zhì)激素，可抑制炎癥細(xì)胞聚集、炎癥介質(zhì)合成和釋放等，有效減輕炎癥反應(yīng)[15-16]。張治成等[17]報(bào)道，鼻竇內(nèi)窺鏡術(shù)后鹽酸氨溴索聯(lián)合Dex霧化治療可顯著降低患者血清IL-5、IL-12水平，緩解鼻竇炎臨床癥狀、促進(jìn)鼻腔黏膜功能恢復(fù)。Yu等[8]報(bào)道，Dex可通過(guò)下調(diào)IL-6、TNF-α表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)性小鼠葡萄膜炎前房炎癥，對(duì)小鼠葡萄膜炎有保護(hù)作用。綜合以上研究及本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，Dex可減輕ARPE-19細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可能與下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6因子的表達(dá)有關(guān)。

NLRP3在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中大量表達(dá)，可通過(guò)LRR結(jié)構(gòu)域與其配體結(jié)合，募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ACS)、Caspase形成復(fù)雜炎性小體，產(chǎn)生活化的Caspase-1(又稱(chēng)IL-1β轉(zhuǎn)化酶)，進(jìn)而將IL-Iβ前體裂解為成熟IL-1β分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。NLRP3還可激活NF-κB信號(hào)通路，引起IL-1、TNF-α、IL-8等大量促炎因子產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[18-19]。Qu等[20]報(bào)道，肉桂醛可通過(guò)抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎細(xì)胞RAW264.7中NLRP3炎癥小體表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6活性，減輕潰瘍性結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)。Bian等[21]報(bào)道，Dex處理單側(cè)角膜中央堿燒傷大鼠，可下調(diào)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平,抑制NLRP3炎癥小體通路，促進(jìn)角膜堿燒傷創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示，與LPS組比較，Dex+LPS組ARPE-19細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示Dex可能通過(guò)下調(diào)NLRP3、Caspase-1的表達(dá)抑制NLRP3/Caspase-1通路。

綜上所述，Dex可能通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1通路下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，減輕LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞炎癥損傷作用。但Dex抑制ARPE-19細(xì)胞炎癥損傷的具體作用機(jī)制及是否還存在其他通路共同作用尚不完全清楚，有待后期進(jìn)一步深入探究。本研究結(jié)果可能為視網(wǎng)膜炎癥相關(guān)性眼科疾病的防治提供一定參考。