李晶鑫 魏亞芬 殷萍

【摘 要】目的：探討胰高血糖素樣多肽-1（Glucagon like polypeptide -1，GLP-1）對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）神經(jīng)元磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）- 蛋白激酶B（AKT）- 糖原合成酶激酶 3（GSK3β）通路調(diào)節(jié)作用。方法：以Aβ25-35孵育神經(jīng)元細(xì)胞系PC12細(xì)胞制備的AD細(xì)胞模型為研究對(duì)象，分為3組：空白對(duì)照組、Aβ組和Aβ+GLP-1組.使用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，Western blot 方法檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K-AKT-GSK3β表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，Aβ組細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.05）;與Aβ組相比，Aβ+GLP-1組細(xì)胞存活率明顯升高（P<0.05）。Aβ組PI3K、AKT表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，GSK3β表達(dá)水平高于空白對(duì)照組（P<0.05）;Aβ+GLP-1組PI3K、AKT表達(dá)水平明顯高于Aβ組，GSK3β表達(dá)水平低于Aβ組（P<0.05）。結(jié)論：GLP-1通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT-GSK3β的表達(dá)水平改善AD細(xì)胞模型存活率。

【關(guān)鍵詞】胰高血糖素樣多肽-1;阿爾茨海默病;神經(jīng)元

【中圖分類(lèi)號(hào)】R749.16【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1002-8714（2020）09-0124-01

AD是目前生活中常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性進(jìn)展性的退行性疾病，臨床上常見(jiàn)表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶功能減退和認(rèn)知功能障礙[1]。胰高血糖素樣多肽一1（Glucagon-1ike peptide-1，GLP-1）可通過(guò)與GLP-1受體的介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用[2]。GLP-1是由腸粘膜內(nèi)分泌細(xì)胞以及腦神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生的一種多肽類(lèi)激素，可以通過(guò)一種特異的肽轉(zhuǎn)運(yùn)體經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入大腦[3]。本文旨在分析GLP-1對(duì)AD神經(jīng)元PI3K-AKT-GSK3β通路調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料

以Aβ25-35孵育神經(jīng)元細(xì)胞系PC12細(xì)胞制備的AD細(xì)胞模型為研究對(duì)象，分為3組：空白對(duì)照組、Aβ組和Aβ+GLP-1組.

1.2方法

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、Aβ 組、Aβ+GLP-1組。Aβ的濃度均為 20 μmol/，Aβ+GLP-1組：先加Aβ孵育 1 h 后再加GLP-1，GLP-1濃度為20 μmol/L。使用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率，Western-Blot法檢測(cè)各組PI3K-AKT-GSK3β的表達(dá)。

1.3觀察指標(biāo)

MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率：取各組細(xì)胞，去除細(xì)胞消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液5ml，吹打成懸液后，離心1500r/m2min，棄上清，再使用同種培養(yǎng)液吹打調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種在96孔板100μL/孔，放置在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24h。然后每孔加入20μlMTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后取上清，每孔加入150μlDMSO，劇烈搖晃10min，溶解結(jié)晶。上酶標(biāo)儀取波長(zhǎng)為，比色記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）

Western-Blot檢測(cè)：在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)終止的時(shí)間點(diǎn)收集樣本，裂解細(xì)胞，提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度。利用聚丙烯酰胺-凝膠電泳根據(jù)蛋白的分子量分離蛋白：將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜;第二天充分洗滌后二抗室溫孵育1h;最后加ECL反應(yīng)液后曝光。確定特異性蛋白條帶后用Image J軟件定量檢測(cè)條帶的灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用spss19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（-x±s），組間比較采用F檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞存活率的對(duì)比：與空白對(duì)照組相比，Aβ組細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.05）;Aβ+GLP-1組細(xì)胞存活率明顯高于空白對(duì)照組和Aβ組（P<0.05）。（詳見(jiàn)表1）

3 討論

PI3K-AKT-GSK3β通路由PI3K、AKT及GSK3β三部分組成，是神經(jīng)系統(tǒng)里重要的信號(hào)通路，參與神經(jīng)元極性、神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)維持和神經(jīng)元凋亡等，具有多種關(guān)鍵的調(diào)控作用。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能。AKT作為PI3K的下游蛋白分子，在代謝葡萄糖和細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄及凋亡中起到重要作用。GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，普遍存在于體內(nèi)真核細(xì)胞中，與眾多蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子相作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，AD患者神經(jīng)元PI3K-AKT表達(dá)水平明顯降低，GSK3β升高。

GLP-1是一種氨基酸組成的內(nèi)源性胰島素樣腸肽，可調(diào)節(jié)血糖，相關(guān)研究顯示，GLP-1可起到保護(hù)神經(jīng)和抑制老年斑生成的作用，這提示GLP-1在防治AD方面有積極作用。本研究應(yīng)用GLP-1對(duì)AD細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，觀察GLP-1的神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)PI3K-AKT-GSK3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。有相關(guān)文獻(xiàn)顯示，GLP-1及其衍生物已被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用，且能改善AD模型的記憶和認(rèn)知功能。但GLP-1是否通過(guò)PI3K-AKT-GSK3β通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有待研究。

從本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：① GLP-1可以改善AD細(xì)胞模型存活率。②與正常對(duì)照組相比，Aβ可使PI3K、AKT表達(dá)降低，GSK3β表達(dá)升高。③GLP-1可以逆轉(zhuǎn)Aβ引起的PI3K、AKT表達(dá)降低、GSK3β表達(dá)升高。以上結(jié)果提示GLP-1通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT-GSK3β的表達(dá)水平改善AD細(xì)胞模型存活率。

參考文獻(xiàn)

[1] 曾高峰， 宗少暉， 傅松文，等. PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路在6-姜酚保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2015， v.27（11）：25-28.

[2] 吳愛(ài)兵， 黎明春， 麥宗炯，等. CK2α通過(guò)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲及遷移[J]. 中國(guó)肺癌雜志， 2017， 020（004）：233-238.