1. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001

崗松BaeckeafrutescensL.為桃金娘科崗松屬植物，廣布于東南亞及我國(guó)的南部地區(qū)，是重要的香料及藥用植物資源。崗松揮發(fā)油為崗松枝葉經(jīng)水蒸氣蒸餾法制得，為淡黃色至淡棕黃色的澄清液體，具有特殊香味[1]，以其為主要原料的香精產(chǎn)品、防蚊輕工品在市場(chǎng)上頗受青睞[2-3]；此外作為廣西習(xí)用中藥收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、廣西壯族自治區(qū)《壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有殺蟲止癢、清熱利濕、祛痱、止痛、除濕的功效[4-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)基礎(chǔ)上，以“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)為理念，運(yùn)用專業(yè)的可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行虛擬篩選和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，從而揭示藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響；其研究的整體性與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)相吻合，成為解析中藥復(fù)雜體系的有利工具[7-9]。目前，崗松油多用于皮膚濕疹、淋病、瘙癢、疥瘡、滴蟲性陰道炎及腳癬的治療，但缺乏較為系統(tǒng)深入的現(xiàn)代藥理研究。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)方法，通過分析構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-通路-疾病-組織”網(wǎng)絡(luò)，對(duì)崗松油藥效組分、藥理作用及其機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，為崗松油在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步研發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 崗松揮發(fā)油化學(xué)成分及靶蛋白篩選 通過文獻(xiàn)檢索整理崗松揮發(fā)油化學(xué)成分，結(jié)合Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.gov/)獲得崗松揮發(fā)油相關(guān)化學(xué)成分的CAS號(hào)及SMILES結(jié)構(gòu)式，借助TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、SEA(http://sea.bkslab.org/)及SwissTargetPrediction(http:// swissTarGetprediction.ch/)等數(shù)據(jù)庫(kù)篩選化學(xué)成分相關(guān)靶蛋白，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0構(gòu)建崗松揮發(fā)油“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶標(biāo)篩選 通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，對(duì)崗松油化學(xué)成分靶標(biāo)進(jìn)行蛋白相互作用(PPI)分析，選擇物種“Homo spaiens”，設(shè)定最低相互作用閾值為中等置信度“Medium confidence(0.4)”，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0構(gòu)建構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖；結(jié)合網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，選取大于2倍平均度值(degree)的靶標(biāo)作為關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.3 GO分析及KEGG通路富集 利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID(https://david.ncifcrf. gov/，Version 6.8)，對(duì)崗松揮發(fā)油關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置標(biāo)識(shí)符為“official gene symbol”，限定物種為“homo sapiens”，并通過R語言將GO、KEGG分析結(jié)果可視化。

1.4 疾病及組織分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)崗松揮發(fā)油關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行疾病、組織富集分析，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建“疾病分析”“組織分布”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 崗松揮發(fā)油“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索收集崗松揮發(fā)油化學(xué)成分66個(gè)(表1)，相關(guān)靶蛋白542個(gè)；利用Cytoscape 3.6.0構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)中共有608個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括成分節(jié)點(diǎn)66個(gè)(方形)、靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)542個(gè)(圓形)；2863條邊，分別代表“成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)”之間的相互關(guān)系；節(jié)點(diǎn)大小及顏色深淺與節(jié)點(diǎn)的degree值(網(wǎng)絡(luò)中和該節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)量)呈正比。其中，20、26、56、36、58、40、31、59、21、43、28、39、10、42、1、17、18、46等18個(gè)化合物的degree值較大，提示為崗松揮發(fā)油發(fā)揮藥效的主要活性成分。

表1 崗松揮發(fā)油化合物信息

續(xù)表1表1 崗松揮發(fā)油化合物信息

圖1 崗松揮發(fā)油“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 關(guān)鍵靶標(biāo) 通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建542個(gè)靶蛋白相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0中進(jìn)行可視化處理；以大于平均degree(31.587)的2倍為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合條件的46個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，結(jié)果如圖2所示。

2.3 GO生物功能與KEGG通路富集分析

2.3.1 GO分析 通過GO分析，共確定了424個(gè)GO條目(Pvalue<10-6)：細(xì)胞組分(CC)涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩、基地外側(cè)質(zhì)膜等15個(gè)條目，分子功能(MF)涉及蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、核受體結(jié)合等23個(gè)條目，生物過程(BP)涉及脂多糖相關(guān)反應(yīng)、蛋白質(zhì)定位建立的調(diào)控、細(xì)菌源分子相關(guān)反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等386個(gè)相關(guān)條目，GO富集結(jié)果如圖3所示。

圖2 關(guān)鍵靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 關(guān)鍵靶標(biāo)-GO分析條形圖

2.3.2 KEGG分析 通過KEGG富集分析，共確定了92條相關(guān)通路(Pvalue<10-6)，包括癌癥相關(guān)通路(癌癥中的蛋白多糖、癌癥通路、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌等)、傳染病相關(guān)通路(乙肝、利什曼病、結(jié)核、百日咳等)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等)、內(nèi)分泌和代謝相關(guān)通路(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路等)等，KEGG通路分析結(jié)果如圖4所示。

2.4 疾病分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行疾病分析，共得到266個(gè)相關(guān)疾病(Pvalue<10-6，F(xiàn)DR<0.01)，主要涉及多種癌癥疾病(結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等)、婦科疾病(子宮內(nèi)膜異位癥、復(fù)發(fā)性妊娠損失、絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥等)、慢性疾病(慢性阻塞性肺疾病、2型糖尿病等)等。結(jié)果如圖5所示。

圖4 關(guān)鍵靶標(biāo)-KEGG通路富集分析

圖5 關(guān)鍵靶標(biāo)-疾病分析結(jié)果

2.5 組織分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行組織分析(Pvalue<0.05)，共得到32個(gè)相關(guān)組織，包括小腦(正常)、骨髓(BM-CD34+、BM-CD33+)、骨骼肌、扁桃體、頸神經(jīng)節(jié)、唾液腺、肝臟(正常、腫瘤)等組織，結(jié)果如圖6所示。圖中圓形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶標(biāo)，方形節(jié)點(diǎn)代表組織，節(jié)點(diǎn)顏色深淺與節(jié)點(diǎn)degree值呈正比。

2.6 崗松揮發(fā)油關(guān)鍵靶標(biāo)-作用通路-疾病-組織網(wǎng)絡(luò) 將46個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)及排名前10的KEGG通路、疾病、組織分析結(jié)果一起導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0中構(gòu)建“關(guān)鍵靶標(biāo)-作用通路-疾病-組織”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖7所示。其中，圓形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)(46個(gè))，六邊形代表通路(10個(gè))，正方形代表疾病(10個(gè))，菱形代表組織(10個(gè))。

圖6 關(guān)鍵靶標(biāo)-組織分布結(jié)果

圖7 崗松揮發(fā)油關(guān)鍵靶標(biāo)-作用通路-疾病-組織網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

揮發(fā)油類為崗松主要化學(xué)成分之一，文章基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析探討其藥效組分、藥理作用及機(jī)制。通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選崗松油化學(xué)成分66個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)542個(gè)，其中橙花叔醇、龍腦、丁香酚、乙酸橙花酯、香芹酚、α-Cadinol、α-Elemene、乙酸香葉酯、d-檸檬烯、百里香酚、γ-Eudesmol、冰片、芳樟醇等18個(gè)化合物在“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中degree值較大，可作為主要活性成分；通過AKT1、ALB、IL6、MAPK3、TP53、VEGFA、SRC、TNF、CASP3等關(guān)鍵靶標(biāo)，主要參與脂多糖相關(guān)反應(yīng)、蛋白質(zhì)定位建立的調(diào)控、細(xì)菌源分子相關(guān)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等生物過程，作用于包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖通路、內(nèi)分泌抵抗通路、IL-17信號(hào)通路在內(nèi)的多種癌癥通路、傳染病通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、內(nèi)分泌和代謝相關(guān)通路等發(fā)揮作用；且疾病分析和組織分布顯示，崗松油主要作用于小腦、骨髓、骨骼肌、扁桃體等組織及器官，可對(duì)結(jié)直腸癌、前列腺癌、慢性阻塞性肺疾病、子宮內(nèi)膜異位癥等多種癌癥、慢性疾病、婦科疾病及其他病癥發(fā)揮治療作用。

含崗松油的多為外用制劑，對(duì)外治滴蟲性陰道炎、皮膚濕疹、蛇蟲咬傷、燒燙傷等具有抗菌消炎、清潔護(hù)膚等作用[10-11]，而對(duì)本研究所預(yù)測(cè)的多種癌癥、慢性疾病及婦科病等尚未有報(bào)道；其中糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路表明[12-15]，AGE、RAGE可通過誘導(dǎo)PI3K-Akt依賴的信號(hào)途徑激活，進(jìn)而產(chǎn)生NF-κB活性，促進(jìn)細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)、促凋亡相關(guān)基因CASP3、細(xì)胞增殖導(dǎo)致腎功能不全相關(guān)基因CYCD1、及促血管形成相關(guān)基因VEGF等的表達(dá)，從而誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥；癌癥相關(guān)通路表明[16-19]，所篩選的關(guān)鍵靶標(biāo)通過多通路多靶點(diǎn)，對(duì)下游多個(gè)通路進(jìn)行整體調(diào)控，如激活cAMP信號(hào)通路進(jìn)而激活PKA、激活PI3K-Akt信號(hào)通路進(jìn)而連續(xù)激活PKB/Akt，使下游相關(guān)靶點(diǎn)磷酸化被激活或抑制等，這些作用通路均與癌癥相關(guān)；因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析在闡釋傳統(tǒng)藥效機(jī)制的同時(shí)，也進(jìn)一步挖掘了崗松油其可能的、潛在的藥理作用。

本研究通過構(gòu)建崗松揮發(fā)油“化學(xué)成分-靶標(biāo)-通路-疾病-組織”網(wǎng)絡(luò)，分析探討其發(fā)揮藥理作用的活性成分、作用靶點(diǎn)及通路，為崗松油后續(xù)的系統(tǒng)深入研究提供理論依據(jù)。