金杯 戴盼盼 孫旺 顧衛(wèi)燕 林海升 施更生

牙周炎是常見的口腔慢性疾病，與糖尿病相互影響且互為易感因素[1-2]。糖尿病患者牙周組織破壞更顯著，疾病發(fā)展更迅速，是目前臨床研究的難點。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡貫穿糖尿病性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展[1]，而成骨細胞凋亡在牙周炎牙槽骨吸收中起關鍵作用。甲基乙二醛作為牙周炎與糖尿病的共同致病因素，可由牙周炎致病菌福賽類桿菌產(chǎn)生[3]，并且在糖尿病患者血清中高濃度存在，與糖尿病以及腎病、心血管病、白內(nèi)障等多種糖尿病并發(fā)癥密切相關。槲皮素是一種人類飲食中廣泛存在的天然黃酮類化合物，具有強大的抗氧化和抗炎活性，并被認為在治療和預防包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病在內(nèi)的疾病中發(fā)揮作用，已被證實具有抗糖尿病潛力[4]。糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β）負向調(diào)控轉錄因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2），與細胞抗氧化、抗炎和抗凋亡等能力有關[5]。Bcl-2家族蛋白，包括Bcl-2和Bax，在線粒體凋亡級聯(lián)反應中發(fā)揮著重要作用。Bcl-2位于線粒體外膜上，起著抑制凋亡作用，而Bax移位到線粒體上，增加線粒體膜的通透性，促進細胞色素C的釋放，進而啟動凋亡。因此，目前認為細胞內(nèi)Bcl-2、Bax這兩種對立蛋白的比率關系是決定細胞凋亡的關鍵[6]。本研究通過體外培養(yǎng)成骨細胞，觀察甲基乙二醛處理對細胞Bcl-2、Bax表達及GSK－3β/Nrf2信號通路的影響及槲皮素的干預作用，以期為槲皮素在糖尿病牙周炎的臨床應用提供理論基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）細胞株：小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞系購自美國ATCC細胞庫。（2）藥物與試劑：α-MEM細胞培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶（美國Gibco公司），甲基乙二醛、槲皮素、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、β-actin一抗（美國Sigma公司），Bcl-2、Bax、p-GSK－3β（Ser9）、GSK－3β、Nrf2 一抗（美國Cell Signaling Technology公司），4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國 Invitrogen公司），TUNEL試劑盒（瑞士Roche公司），二抗（上海碧云天生物技術有限公司）。（3）主要儀器：酶標儀（美國Bio-TEK公司），流式細胞儀（美國Becton公司），正置熒光顯微鏡（德國Leica公司），電泳儀、曝光儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將MC3T3-E1細胞接種于含10% FBS和100 U/ml青霉素G和100 ng/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

1.2.2 細胞分組與處理 將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞隨機分為4組。（1）對照組：MC3T3-E1細胞用α-MEM培養(yǎng)基（加入FBS）培養(yǎng)。（2）甲基乙二醛組：MC3T3-E1細胞用半數(shù)抑制濃度的甲基乙二醛培養(yǎng)24 h。（3）槲皮素組：MC3T3-E1細胞用6.25 μmol/L槲皮素培養(yǎng)25h。（4）槲皮素+甲基乙二醛組：MC3T3-E1細胞用6.25 μmol/L槲皮素預培養(yǎng)1 h，再加入半數(shù)抑制濃度的甲基乙二醛培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。將對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞接種于96孔板（104個/孔），培養(yǎng)24 h后按不同分組處理后換α-MEM培養(yǎng)基（無血清），每孔加入 20 μl 5 mg/ml的 MTT ，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μl DMSO，待結晶完全溶解后酶標儀490 nm處檢測吸光度值。細胞存活率（%）=（各實驗組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值）/（對照組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值）×l00%。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙標記結合流式細胞儀以及TUNEL染色法。Annexin V-FITC/PI法：將消化收集的細胞調(diào)整密度至106個/ml，室溫避光加入Annexin V-FITC，再加入PI，孵育10 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡。TUNEL染色法：將各處理組細胞爬片用4%多聚甲醛室溫固定1 h，2～8℃溫度下通透液（體積分數(shù)0.1% Triton X-100和質(zhì)量分數(shù)0.1%檸檬酸鈉配成）處理2 min，再用50 μl反應液37℃避光孵育1 h，用含有DAPI的封片劑封片，室溫避光24 h后正置熒光顯微鏡觀察拍照，計數(shù)300個細胞計算凋亡率。

1.2.5 蛋白表達檢測 采用Western blot法。用裂解液（RIPA裂解液與PMSF按100：1的比例配置）充分裂解細胞，超聲后高速離心機4℃ 12 000 r/min離心，上清液-80℃分裝保存。采用BCA法測定蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)至相同后與上樣緩沖液混合，100℃煮沸10 min使蛋白充分變性。配制5%濃縮膠以及12%分離膠，每孔上樣20 μg蛋白，SDS-PAGE電泳分離后濕轉法將蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，將膜分別轉入含一抗的稀釋液中（Bcl-2、Bax、p-GSK-3β、GSK-3β、Nrf2 1：2 000，β-actin 1：3 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光成像儀曝光，掃描圖像并用Image J軟件分析灰度。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲基乙二醛對成骨細胞的半數(shù)抑制濃度 0、100、200、300、400、500、600、700 μmol/L 的甲基乙二醛處理成骨細胞24 h后，細胞存活率分別為100.00%、95.51%、86.21%、77.83%、78.13%、72.10%、48.15%、5.32%（P ＜0.05），說明甲基乙二醛能抑制成骨細胞增殖活性，并呈濃度依賴性，600 μmol/L是甲基乙二醛對成骨細胞的半數(shù)抑制濃度，見圖1。

圖1 不同濃度甲基乙二醛對成骨細胞增殖活性的影響（與對照組比較，*P＜ 0.05）

2.2 甲基乙二醛組與對照組成骨細胞凋亡情況比較 流式細胞術結果顯示甲基乙二醛組細胞凋亡率為41.60%，明顯高于對照組（P＜0.05），說明甲基乙二醛誘導細胞死亡類型以凋亡為主。此外，TUNEL染色結果顯示，甲基乙二醛組細胞染色陽性率為35.53%，高于對照組（P＜0.05），進一步說明甲基乙二醛可以誘導成骨細胞凋亡，見圖2。

2.3 甲基乙二醛組與對照組成骨細胞Bcl-2、Bax表達水平比較 Western blot結果示，與對照組相比，甲基乙二醛組成骨細胞Bcl-2表達水平下降（P＜0.05），而Bax表達水平升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax比率下降，進一步驗證甲基乙二醛可誘導成骨細胞凋亡，見圖3。

2.4 甲基乙二醛組與對照組成骨細胞GSK-3β/Nrf2信號通路相關蛋白表達水平比較 Western blot結果示，與對照組相比，甲基乙二醛組p-GSK-3β、Nrf2表達水平均明顯下降（均P＜0.05），見圖4。

2.5 槲皮素干預對成骨細胞增殖活性的影響 MTT結果所示，低濃度的槲皮素對成骨細胞增殖活性無明顯影響，而25、50 μmol/L高濃度的槲皮素處理后細胞存活率分別為89.48%、84.58%，說明高濃度的槲皮素有細胞毒性。此外，與甲基乙二醛組比較，低濃度的槲皮素預處理后能明顯恢復細胞增殖活性，6.25 μmol/L的槲皮素保護效果最好，故后續(xù)實驗采取該濃度，見圖5。

2.6 槲皮素+甲基乙二醛組、槲皮素組、甲基乙二醛組、對照組細胞凋亡情況和Bcl-2、Bax表達水平比較 與甲基乙二醛組相比，槲皮素+甲基乙二醛組TUNEL細胞染色陽性率降低（P＜0.05），說明細胞凋亡減少。此外，與甲基乙二醛組相比，槲皮素+甲基乙二醛組Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平下降，進一步說明槲皮素能緩解甲基乙二醛誘導的成骨細胞凋亡，見圖6。

圖2 甲基乙二醛組與對照組成骨細胞凋亡情況比較[與對照組比較，*P＜0.05；a：流式細胞圖；b：細胞凋亡率比較；c：TUNEL染色結果（×200）；d：TUNEL 陽性細胞率比較]

圖3 甲基乙二醛組與對照組成骨細胞Bcl-2、Bax表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05；a：蛋白電泳圖；b：Bcl-2表達水平比較；c：Bax表達水平比較）

圖4 甲基乙二醛組與對照組成骨細胞糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路相關蛋白表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05；a：蛋白電泳圖；b：p-GSK-3β 表達水平比較；c：GSK-3β 表達水平比較；d：Nrf2表達水平比較）

圖5 槲皮素干預對成骨細胞增殖活性的影響（a：不同濃度槲皮素對細胞增殖活性的影響；b：槲皮素對甲基乙二醛細胞增殖活性干預的影響）

2.7 槲皮素+甲基乙二醛組、槲皮素組、甲基乙二醛組、對照組細胞GSK-3β/Nrf2信號通路相關蛋白表達水平比較 槲皮素組與對照組細胞p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與甲基乙二醛組相比，槲皮素+甲基乙二醛組p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達水平升高（均P＜0.05），見圖7。

圖6 槲皮素+甲基乙二醛組、槲皮素組、甲基乙二醛組、對照組細胞凋亡情況和Bcl-2、Bax表達水平比較[a：TUNEL染色結果（×200）；b：TUNEL 陽性細胞率比較；c：Bcl-2、Bax蛋白電泳圖；d：Bcl-2 表達水平比較；e：Bax表達水平比較]

3 討論

牙周炎是最常見的口腔慢性疾病，是中國成人失牙的首位因素，其作為糖尿病的第六大并發(fā)癥，兩者之間息息相關：牙周感染會降低胰島素功能，不利于血糖控制；而糖尿病患者抗感染能力降低是牙周病的重要危險因素[7]。因此，糖尿病性牙周炎已成為了牙周病預防及治療中的難點和重點。牙槽骨破壞是牙周炎的重要病理特征，是造成牙齒松動和脫落的直接原因。有研究顯示，糖尿病牙周炎的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡密切相關，在糖尿病病理條件下，牙周支持組織中成骨細胞凋亡增加，進一步限制了骨組織的愈合[1，8]。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于飲食及中草藥中，對人體無毒、無三致作用，國內(nèi)外對其研究日益增多，已被證實具有抗感染、抗氧化等藥理活性，并對癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等多種疾病有潛在治療效果[9]。近年來，槲皮素在糖尿病中的應用被愈發(fā)關注。Vieira-Frez等[10]發(fā)現(xiàn)槲皮素能緩解糖尿病大鼠神經(jīng)元細胞、巨噬細胞的氧化應激損傷。Hu等[11]以小鼠為模型發(fā)現(xiàn)槲皮素能通過SIRT1/NLRP3通路預防糖尿病腦病。Daniel等[12]證實槲皮素能抑制線粒體膜通道，減少肝細胞凋亡緩解糖尿病大鼠肝損傷。類似的，Roslan等[13]發(fā)現(xiàn)槲皮素能緩解糖尿病大鼠心肌細胞凋亡。因此，本研究初步探討槲皮素保護成骨細胞的效果及機制。

甲基乙二醛是一種有毒代謝產(chǎn)物，在糖尿病的高糖病理環(huán)境下，磷酸酶使磷酸二羥丙酮生成二羥丙酮，進而形成甲基乙二醛。研究發(fā)現(xiàn)甲基乙二醛是牙周炎重要致病菌福賽類桿菌的產(chǎn)物，其濃度在牙周炎患者齦溝液中比正常者可高出15～20倍[3]。此外，甲基乙二醛能誘發(fā)牙周組織的炎癥反應[14]，誘導牙齦成纖維細胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)甲基乙二醛能夠抑制成骨細胞增殖活性，并且呈濃度依賴性。此外，流式細胞術結果顯示甲基乙二醛能夠誘導成骨細胞凋亡。TUNEL染色是對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡，本實驗條件下，甲基乙二醛組TUNEL染色細胞陽性率明顯高于對照組，說明細胞凋亡增加，與既往實驗相符。Western blot結果示線粒體凋亡級聯(lián)反應中的關鍵蛋白Bcl-2/Bax比率下降，一般認為抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相互作用并抑制Bax的促凋亡作用，而Bcl-2/Bax比率下降說明Bax蛋白功能占優(yōu)勢，從而發(fā)揮促凋亡作用，進一步驗證了凋亡結果。而槲皮素干預后顯著恢復了甲基乙二醛抑制的成骨細胞增殖活性，同時減少了細胞凋亡，說明其對成骨細胞有很好的保護作用。

圖7 槲皮素+甲基乙二醛組、槲皮素組、甲基乙二醛組、對照組細胞糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路相關蛋白表達水平比較（與甲基乙二醛組比較，*P＜0.05；a：蛋白電泳圖；b：p-GSK-3β表達水平比較；c：GSK-3β表達水平比較；d：Nrf2表達水平比較）

為了進一步揭示槲皮素的作用機制，本研究探討了GSK-3β/Nrf2信號通路在其中的作用。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能通過降解β連環(huán)蛋白從而阻斷Wnt通路，影響成骨細胞增殖分化。此外，GSK-3β能調(diào)控線粒體膜通道的開放，當其Ser9位點磷酸化后線粒體膜通道開放抑制，減少了線粒體膜通透性，減少細胞色素C的釋放，抑制Caspase-3/9活性，從而抑制線粒體凋亡途徑，減少細胞凋亡[16]。Nrf2是重要的內(nèi)源性抗氧化調(diào)節(jié)因子，當細胞受到氧化應激損傷時，細胞質(zhì)中Nrf2轉移入細胞核，調(diào)控大量有抗氧化作用基因表達。研究證實GSK-3β激活后負向調(diào)控Nrf2，影響細胞的氧化還原狀態(tài)，抑制Nrf2的保護作用[17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)丹酚酸A能通過GSK-3β/Nrf2信號通路抗氧化應激保護腎臟。此外，激活GSK-3β/Nrf2信號通路被證實能緩解糖尿病病理狀態(tài)下的心肌病[19]以及促進肢體缺血中的血管生成[20]。本研究中甲基乙二醛在誘導成骨細胞凋亡的過程中GSK-3β的Ser9位點磷酸化降低，Nrf2蛋白水平降低，GSK-3β/Nrf2信號通路被抑制。而槲皮素干預后GSK-3β磷酸化水平以及Nrf2蛋白表達水平上升，說明槲皮素對成骨細胞的保護作用可能是通過GSK-3β/Nrf2信號通路來介導的。

綜上所述，本研究結果顯示，GSK-3β/Nrf2信號通路參與了甲基乙二醛誘導的成骨細胞凋亡，而槲皮素對成骨細胞凋亡的保護作用可能依賴于該通路。但本研究為單純體外實驗，需進一步研究證實，從而為臨床應用提供理論基礎。