樊麗超 吳浩宇 程漠鑫 楊一帆 王曉虹 于艷紅 陳禹

據(jù)全球數(shù)據(jù)模型估算，每年約有2.5萬～3.2萬例新發(fā)兒童耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者，而登記報告至WHO的最終患者數(shù)不足1000例，登記報告與最佳估算數(shù)據(jù)之間的巨大缺口提示存在大量兒童MDR-TB患者未被發(fā)現(xiàn)[1-2]。最近一項研究聯(lián)合分析了WHO的MDR-TB治療數(shù)據(jù)和已公布的兒童病死率估計值，結(jié)果表明，未治療的MDR-TB占兒童死亡原因的22%[3]。兒童MDR-TB的危害是巨大的，而各區(qū)域的耐藥數(shù)據(jù)和治療經(jīng)驗相對缺乏。有少量針對我國不同地區(qū)的基于醫(yī)院患者的研究顯示，兒童結(jié)核病耐藥水平差異較大[4-6]，提示可能因環(huán)境、經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療水平、種族等諸多因素導(dǎo)致我國不同地區(qū)兒童的結(jié)核病耐藥現(xiàn)狀不同。因此，有必要在我國不同地區(qū)開展大樣本的兒童結(jié)核病患者耐藥相關(guān)的調(diào)查及研究。本研究對沈陽市第十人民醫(yī)院2017—2019年314例兒童結(jié)核病患者BACTEC MGIT 960陽性培養(yǎng)物的臨床分離株開展了耐藥性研究，分析兒童結(jié)核病患者的耐藥情況，研究耐多藥相關(guān)的危險因素，在臨床缺失樣本或無法獲得藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果的情況下，為評估兒童結(jié)核病的耐多藥風(fēng)險及制定有效的結(jié)核病防控策略提供參考。

資料和方法

一、研究對象

1.患者及菌株來源：收集沈陽市第十人民醫(yī)院2017年1月31日至2019年12月31日收治的來自遼寧省9個城市(沈陽市、營口市、本溪市、鞍山市、遼陽市、錦州市、阜新市、朝陽市、鐵嶺市)臨床診斷為兒童結(jié)核病患者1275例，所有患者均對病變部位獲取標(biāo)本進(jìn)行了BACTEC MGIT 960培養(yǎng)，其中培養(yǎng)陽性且菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌(MTB)菌株314株，培養(yǎng)陽性率為24.6%(314/1275)，陽性分離株標(biāo)本分別來自痰[66.9%(210/314)]、灌洗液[20.7%(65/314)]、胸腔積液[3.2%(10/314)]、病灶活檢組織[1.6%(5/314)]、腦脊液[1.6%(5/314)]、膿液[4.5%(14/314)]、便[0.6%(2/314)]、腹腔積液[0.3%(1/314)]、心包積液[0.3%(1/314)]、尿液[0.3%(1/314)]。

2. 研究對象一般情況：314例患者年齡范圍1～18歲，中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]為17(15，18)歲；男178例，女136例。有結(jié)核病患者接觸史者13.1%，初治80.6%，有BCG接種史94.0%，有吸煙史3.8%，并發(fā)營養(yǎng)不良16.9%，規(guī)律用藥90.8%，居住農(nóng)村53.2%(表1)。

表1 314例兒童結(jié)核病患者的一般資料

3.倫理學(xué)：本研究通過沈陽市第十人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：KYXM-2019-010-01)。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤18歲；(2)經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性確診的結(jié)核病患者；(3)培養(yǎng)陽性分離株經(jīng)菌種鑒定為MTB；(3)患者信息完整并可獲取藥敏試驗結(jié)果。

2排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)培養(yǎng)陽性分離株經(jīng)菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌；(2)信息重復(fù)的患者。

三、相關(guān)定義

兒童結(jié)核病及耐藥結(jié)核病參照《WS 196—2017 結(jié)核病分類》[7]進(jìn)行診斷。(1)初治結(jié)核病。指有下列情況之一者：①從未因結(jié)核病應(yīng)用過抗結(jié)核藥品治療的患者；②正進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案規(guī)律用藥而未滿療程的患者；③不規(guī)則化療未滿1個月的患者。(2)復(fù)治結(jié)核病。指有下列情況之一者：①因結(jié)核病不合理或不規(guī)律服用抗結(jié)核藥品治療超過1個月的患者；②初治失敗和復(fù)發(fā)患者。(3)單耐藥結(jié)核病(mono-resistant tuberculosis, MR-TB)。對1種或1種以上一線抗結(jié)核藥品耐藥。(4)MDR-TB。結(jié)核病患者感染的MTB體外藥敏試驗證實至少同時對異煙肼(INH)和利福平(RFP)耐藥。(5)廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)。結(jié)核病患者感染的MTB體外藥敏試驗證實除了至少同時對INH和RFP耐藥外，還對任何氟喹諾酮類藥品耐藥，以及3種二線注射類藥品(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1種耐藥。

四、危險因素

收集314例患兒的人口學(xué)信息及臨床資料。根據(jù)臨床實踐納入本研究的相關(guān)危險因素：性別、年齡(<14歲、14～18歲)、是否吸煙、是否并發(fā)營養(yǎng)不良(采用 WHO 推薦的 Z 評分法作為兒童營養(yǎng)不良評價的指標(biāo)，將Z值<-2分定義為營養(yǎng)不良[8-9])、初/復(fù)治情況、居住地(農(nóng)村/城鎮(zhèn))、是否規(guī)律用藥、是否有結(jié)核病接觸史。

五、液體培養(yǎng)及藥敏試驗

根據(jù)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》[10]的要求，采用BACTEC MGIT 960對所收集的臨床標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用微孔板法進(jìn)行藥敏試驗。培養(yǎng)基內(nèi)藥品終濃度：INH分別為0.2、0.4、0.8、1.6 μg/ml；RFP分別為1、2、4、8 μg/ml；鏈霉素(Sm)分別為1、2、4、8 μg/ml；乙胺丁醇(EMB)分別為2.5、5、10、20 μg/ml；左氧氟沙星(Lfx)分別為2、8 μg/ml；莫西沙星(Mfx)分別為0.5、2 μg/ml；阿米卡星(Am)分別為1、4 μg/ml；利奈唑胺(Lzd)分別為2、8 μg/ml；丙硫異煙胺(Pto)分別為10、40 μg/ml。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料報告各分類頻次及率(%)，組間差異比較采用χ2檢驗，相關(guān)因素分析采用非條件 logistic 回歸模型。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、初、復(fù)治患者菌株的耐藥率

314例患者中MTB耐藥85株，耐藥率為27.1%。初治253例患者的菌株中MTB耐藥53株，耐藥率為20.9%，以Sm耐藥為主。復(fù)治61例患者的菌株中MTB 耐藥32株，耐藥率為52.5%，以INH耐藥為主。314例中MDR-TB患者34例，耐多藥率10.8%，初治MDR-TB患者16例，耐多藥率6.3%(16/253)，復(fù)治MDR-TB患者18例，耐多藥率29.5%(18/61)。XDR-TB患者1例，為初治患者。復(fù)治耐藥率明顯高于初治耐藥率(χ2=24.771，P=0.000)。復(fù)治耐多藥率明顯高于初治耐多藥率(χ2=27.360，P=0.000)。

二、9種抗結(jié)核藥品的藥敏試驗結(jié)果及耐藥率排序

耐藥率由高到低依次為：Sm>INH>RFP>Lfx>EMB>Am>Mfx>Lzd>Pto，初治患者菌株耐藥率由高到低依次為：Sm>INH>RFP>Lfx>EMB>Am=Mfx=Lzd=Pto，復(fù)治患者菌株耐藥率由高到低依次為：INH>RFP=Sm>EMB>Lfx>Am>Mfx=Lzd=Pto，耐藥前3位為一線抗結(jié)核藥品Sm、INH、RFP，耐藥后3位為二線抗結(jié)核藥品Pto、Lzd、Mfx(表2)。

三、耐多藥危險因素分析

1.耐多藥患者單因素分析：將MTB臨床分離株所對應(yīng)的結(jié)核病患者按照性別、年齡(<14歲、14～18歲)、吸煙史、是否并發(fā)營養(yǎng)不良等因素與耐藥性進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，不同性別的患者耐多藥率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.218，P=0.641)，14～18歲患者耐多藥率明顯高于<14歲者(χ2=10.322，P=0.042)，吸煙患者與不吸煙患者的耐多藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.235，P=0.030)，營養(yǎng)不良患者的耐多藥率明顯高于無營養(yǎng)不良者(χ2=5.562，P=0.031)，復(fù)治患者的耐多藥率明顯高于初治者(χ2=27.360，P=0.000)，居住于農(nóng)村與城鎮(zhèn)患者的耐多率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.422，P=0.071)，不規(guī)律用藥患者的耐多藥率高于規(guī)律用藥者(χ2=13.511，P=0.002)，有結(jié)核病接觸史患者的耐多藥率高于無接觸史者(χ2=124.566,P=0.000)(表3)。

2.耐多藥患者多因素分析：將性別、年齡、吸煙、營養(yǎng)不良、治療史、居住地和規(guī)律用藥、接觸史等作為自變量(變量賦值見表4)，以患者是否耐多藥為因變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，復(fù)治、14～18歲年齡、并發(fā)營養(yǎng)不良、有吸煙史是兒童患者易發(fā)生耐多藥的危險因素(表5)。

表2 314例兒童結(jié)核病患者對9種抗結(jié)核藥品的耐藥率排序

表3 314例兒童結(jié)核病患者發(fā)生耐多藥的相關(guān)危險因素的單因素分析

表4 非條件 logistic回歸分析變量賦值表

表5 患者耐多藥影響因素的非條件 logistic回歸多因素分析

討 論

耐藥結(jié)核病仍然是一項全球公共衛(wèi)生危機(jī)。WHO[11]2019年度全球結(jié)核病報告顯示，2018年在全球范圍內(nèi)新增約50萬例利福平耐藥結(jié)核病患者(其中78%為MDR-TB)。印度(27%)，中國(14%)和俄羅斯(9%)是全球耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的3個國家。全球耐藥結(jié)核病治療成功率為56%，估算死亡患者數(shù)約21.4萬例。2018年Jenkins和Yuen[3]通過數(shù)學(xué)模型估計：全球每年新增兒童(<15歲)MDR-TB約2.5萬～3.2萬例，約占兒童結(jié)核病的3%，實際患病例數(shù)可能是現(xiàn)有確診患者的12倍。我國2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查和2007—2008全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查并未納入兒童患者，目前缺乏我國不同地區(qū)兒童結(jié)核病流行及耐藥的確切數(shù)據(jù)。

一、兒童結(jié)核病耐藥現(xiàn)況

各國學(xué)者針對本國兒童耐藥結(jié)核病現(xiàn)狀開展了一系列監(jiān)測和研究。韓國的一項兒童結(jié)核病耐藥性調(diào)查共納入了2393株MTB臨床分離株，結(jié)果顯示，菌株的總體耐藥率為13.5%，耐多藥率為4.2%，廣泛耐藥率為0.8%[12]；南非的一項研究分析了1317例 14 歲以下兒童結(jié)核病患者的感染菌株，發(fā)現(xiàn)INH的耐藥率為14.2%，耐多藥率為8.8%[13]。在國內(nèi)，2005—2012年來自我國多地的MTB[其中<15歲組100株，15～18歲組159株，>18歲組(成人組)191株]的耐藥性分析顯示，<15歲組、15～18歲組的總體耐藥率分別為55%、47.2%，耐多藥率分別為22%、22%，與成年人結(jié)核病耐藥率相似(總體耐藥率為60.2%，耐多藥率為30.9%)，提示我國兒童的結(jié)核病耐藥現(xiàn)狀嚴(yán)峻，應(yīng)加以重視[14]。本研究中，≤18歲兒童結(jié)核病總耐藥率是27.1%，耐多藥率為10.8%，廣泛耐藥患者1例，耐藥水平明顯高于國外的2項研究結(jié)果，但是低于國內(nèi)的研究數(shù)據(jù)。2017年我國學(xué)者Tao等[6]收集了2006—2015年山東省36家結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)的784例兒童新發(fā)結(jié)核病患者的MDR-MTB臨床分離株，分析近10年兒童結(jié)核病耐藥水平的變化，結(jié)果顯示，兒童結(jié)核病總體耐藥率由14.7%升高到27.5%，耐多藥率由1.3%升高到15.4%。兒童結(jié)核病的近期耐藥數(shù)據(jù)與本研究的耐藥水平基本一致。本研究報告的兒童患者覆蓋遼寧省9個城市，從一定程度上反映出遼寧省兒童耐藥現(xiàn)狀的嚴(yán)峻性。

二、初/復(fù)治患者耐藥情況分析

本研究中，≤18歲兒童患者總體耐藥率27.1%、初治耐藥率20.9%、復(fù)治耐藥率52.5%。與2017年報道的遼寧省成人肺結(jié)核耐藥情況(總體耐藥率38.16%、初治耐藥率33.63%、復(fù)治耐藥率51.28%)相比[15]，遼寧省兒童結(jié)核病的總體耐藥率和初治耐藥率較低，復(fù)治耐藥率相近。分析原因如下：(1)傳播導(dǎo)致的兒童原發(fā)性耐藥原因不容忽視；本研究中，31.7%的MDR-TB患者具有明確家庭或校園結(jié)核病密切接觸史，提示“直接”傳播對遼寧省兒童結(jié)核病耐藥問題造成巨大影響。高謙和梅建[16]的研究結(jié)果提示，由于傳播導(dǎo)致的原發(fā)性耐藥是造成我國結(jié)核病高耐藥率的主要原因。更有一項國內(nèi)研究顯示，約43.5%的MDR-TB兒童有明確的結(jié)核病接觸史，約23.9%的MDR-TB兒童是初治患者，提示我國MDR-TB兒童多是原發(fā)耐藥，可能是由于免疫功能發(fā)育尚不成熟，易成為MTB的易感者，且可能主要是來自成人MDR-TB患者的“直接”傳播[17]。(2)病原學(xué)延誤診斷可能造成復(fù)治患者耐藥發(fā)生率高；與成年人相比，兒童結(jié)核病病原學(xué)早期診斷及藥敏試驗結(jié)果的獲得更困難。耐藥患者在治療初期多視為敏感患者，采用初治短程化療方案治療結(jié)核病，治療后因結(jié)核病變進(jìn)展進(jìn)一步行纖維支氣管鏡或組織穿刺活檢等有創(chuàng)檢查獲取病原學(xué)標(biāo)本，證實耐藥并判定為復(fù)治。(3)藥品不良反應(yīng)所致的不規(guī)律用藥問題需要關(guān)注；成人耐藥結(jié)核病的獲得性耐藥多考慮在治療過程中由于患者依從性差、不規(guī)范治療或藥品質(zhì)量差等因素，導(dǎo)致體內(nèi)非耐藥的MTB基因組產(chǎn)生特定耐藥突變而造成耐藥。本研究中，18.8%(16/85)的患者因胃腸道不適等藥品不良反應(yīng)出現(xiàn)了不規(guī)律用藥的情況。結(jié)合本研究多因素分析結(jié)果，不規(guī)律用藥與耐多藥的發(fā)生在統(tǒng)計學(xué)上雖無相關(guān)性(P=0.534)，但仍提示應(yīng)及時糾正患者藥品不良反應(yīng)，避免獲得性耐多藥發(fā)生的重要性。

三、兒童結(jié)核病耐藥率排序

不同的耐藥背景、地區(qū)及菌株來源造成各項研究中兒童結(jié)核病耐藥水平差異也較大。墨西哥的一項研究分析了2002—2003年來自19個州的90株分離自18歲以下兒童結(jié)核病患者菌株的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)分離菌株對一線抗結(jié)核藥品的總體耐藥率為26.7%，對INH和RFP耐藥率分別為23.3%和11.1%[18]。本研究對9種抗結(jié)核藥品的耐藥率水平進(jìn)行了排序，與以上研究結(jié)果相近。在一線抗結(jié)核藥品中， Sm(19.1%)、INH(18.5%)和RFP(14.3%)居于耐藥順位的前3位，可見遼寧省結(jié)核病患兒對一線抗結(jié)核藥品的耐藥情況比較嚴(yán)重。因此，在抗結(jié)核治療效果欠佳時,應(yīng)重點考慮患兒是否有Sm、INH和RFP耐藥的可能。

四、兒童MDR-TB的危險因素

本研究結(jié)果顯示，復(fù)治、初高中年齡(14～18歲)組、吸煙史、營養(yǎng)不良者易發(fā)生MDR-TB。復(fù)治患者發(fā)生耐多藥的危險性是初治患者的5.671倍，復(fù)治與存在結(jié)核病接觸史等因素易發(fā)生耐多藥的原因已在前文進(jìn)行了分析闡述。本研究中14～18歲患者發(fā)生耐多藥的危險性是<14歲患者的2.235倍?？紤]可能的原因：初高中年齡組學(xué)業(yè)壓力大與體育鍛煉少增加了結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險，而耐多藥菌株的傳播能力是敏感菌株傳播能力的1.86 倍[19]，因此耐多藥患者也存在聚集發(fā)病情況。近幾年，隨著我國大力加強(qiáng)初高中年齡組學(xué)校結(jié)核病防控，活動性結(jié)核病的篩檢發(fā)現(xiàn)率提高[20]，MDR-TB患病率也可能因源病例耐多藥菌株的傳播而提高。本研究結(jié)果顯示，有吸煙史的患者發(fā)生耐多藥的危險性是不吸煙患者的1.225倍；有學(xué)者的系統(tǒng)綜述也表明吸煙史是肺結(jié)核的危險因素，原因考慮為香煙中的成分會損害肺泡巨噬細(xì)胞的功能，而肺泡巨噬細(xì)胞是MTB感染靶細(xì)胞最重要的早期防御機(jī)制，肺泡巨噬細(xì)胞在吸煙者中功能降低，可導(dǎo)致炎癥因子分泌減少[21]。此外，學(xué)生聚集性吸煙的習(xí)慣會協(xié)同增加MDR-TB傳播的風(fēng)險。而吸煙對于兒童MTB耐多藥的影響還有待進(jìn)一步探討。本研究中，營養(yǎng)不良患者發(fā)生耐多藥的風(fēng)險是無營養(yǎng)不良患者的1.908倍。結(jié)核病與營養(yǎng)不良存在雙向關(guān)系，始終相互影響。多項研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)不良使機(jī)體的免疫功能受到多方面的損害，如樹突狀細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，輔助性T細(xì)胞與抑制性T細(xì)胞的比率下降，這些因素都促進(jìn)了結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展[22]。而兒童營養(yǎng)不良是否增加對MDR-TB的易感性則需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究通過對314例兒童結(jié)核病的耐藥調(diào)查,突顯了臨床工作中早期獲得有效的兒童結(jié)核病檢測樣本及引進(jìn)快速可信賴的分子藥敏檢測方法進(jìn)行藥敏試驗的重要性。盡早識別兒童耐藥結(jié)核病，依照指南規(guī)范化診治及管理可以避免診斷延誤及疫情傳播。本研究數(shù)據(jù)反映了遼寧省兒童結(jié)核病對一線抗結(jié)核藥品的耐藥情況仍較嚴(yán)峻。我們應(yīng)更好地落實耐藥結(jié)核病家庭及校園密切接觸患者的耐藥篩查工作，嚴(yán)格控制耐藥菌株的傳播。本研究危險因素分析提示糾正吸煙等不良嗜好及合理的營養(yǎng)膳食也是防止MDR-TB發(fā)生的重要輔助手段。