楚堯娟，馬雯迪，王夢茹，豆萌萌，杜書章，朱 琳

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特點的自身免疫性疾病，以完全或部分可逆性神經(jīng)功能障礙為主要特征，具有空間多發(fā)性和時間多發(fā)性。目前MS是不可治愈的，雖然已有10多種藥物可以降低MS的復(fù)發(fā)頻率和嚴(yán)重程度，但是沒有藥物能夠完全預(yù)防或逆轉(zhuǎn)MS漸進性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。由于缺乏特異性治療手段，該病給患者及其家庭、醫(yī)療系統(tǒng)和社會帶來了沉重的負擔(dān)[2]，因此迫切需要探索更為有效的MS治療方法。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前公認的研究MS的經(jīng)典動物模型[3]。有研究[4]證實縫隙連接(gap junction，GJ)在EAE損傷中起重要作用，縫隙連接蛋白(connexin，Cx)是GJ的構(gòu)成蛋白，其中Cx43主要分布在星形膠質(zhì)細胞，Cx32主要分布在少突膠質(zhì)細胞[5]。

苦參素又名氧化苦參堿，是從苦參、廣豆根等豆科槐屬植物中提取的天然化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[6]，且不良反應(yīng)較少，在臨床上具有明確的應(yīng)用價值。課題組前期研究[7-8]發(fā)現(xiàn)苦參素能明顯改善EAE小鼠的臨床癥狀，對EAE具有一定的防治作用。本研究通過觀察苦參素對EAE大鼠腦內(nèi)Cx43、Cx32表達的影響，探討苦參素防治EAE的作用機制，為MS的治療提供新的靶點和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器苦參素注射液(批號160919204，規(guī)格2 mL，0.6 g/支，以氧化苦參堿計)購自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司。完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，卡介苗(北京生物制品研究所)，兔抗鼠Cx43、Cx32熒光一抗(美國Abcam公司)，羊抗兔Cy3熒光二抗(武漢三鷹生物工程有限責(zé)任公司)，濃縮型DAPI顯色試劑盒(北京賽馳生物技術(shù)有限公司)，蘇木精(北京索萊寶公司)，伊紅(上海試劑一廠)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus株式會社)。

1.2實驗動物分組、造模及給藥健康雌性Wistar大鼠40只，SPF級，6～8周齡，體重180～200 g(動物批號：37009200001109)；健康雌性豚鼠10只，體重300～350 g[動物批號：SCXK(魯)20130001]；均購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。參照文獻[9]提供的方法制備豚鼠全脊髓勻漿，與等體積含有1 g/L結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑混合，制成穩(wěn)定的油包水型抗原乳劑。采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠分為正常組、模型組、苦參素治療組、苦參素預(yù)防組，每組10只。模型組、苦參素治療組和預(yù)防組大鼠用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，分4點在四肢足墊皮下注射抗原乳劑(0.5 mL/只)，誘導(dǎo)EAE模型。苦參素預(yù)防組于免疫后第1天起腹腔注射苦參素注射液250 mg/kg，1次/d；苦參素治療組于免疫后第11天起腹腔注射苦參素注射液250 mg/kg，1次/d；正常組和模型組于免疫后第1天起腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d。

1.3神經(jīng)功能評分大鼠免疫后每天由兩名實驗人員分別記錄神經(jīng)功能評分，采用5分評分法[10]：0分，無任何臨床癥狀；1分，尾部無力；2分，后肢無力；3分，尾部及雙后肢癱瘓；4分，四肢均癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。神經(jīng)功能評分達到或超過1分，判斷為EAE發(fā)病。

1.4腦組織病理學(xué)檢查免疫后第18天，用100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠后，用預(yù)冷的生理鹽水進行心臟灌注，直至右心耳流出的液體變透明，肝臟變?yōu)橥涟咨缓蠓蛛x全腦，放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水，浸入二甲苯3 h，石蠟包埋，制成5 μm厚的組織切片。40 ℃水中鋪片后，置于45 ℃溫箱烘烤，去除水分后4 ℃保存?zhèn)溆?。組織切片分別進行勒克斯光藍(LFB)和HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并參照以下評分標(biāo)準(zhǔn)[11]進行評分。HE染色：0分，無炎性細胞；1分，存在少量炎性細胞；2分，存在大量炎性細胞聚集；3分，存在大量血管袖套樣病變。LFB染色：0分，無髓鞘脫失情況；1分，1個小范圍髓鞘脫失；2分，存在2～3個小范圍髓鞘脫失；3分，1～2個大范圍髓鞘脫失；4分，廣泛存在大范圍髓鞘脫失。

1.5免疫熒光單標(biāo)法檢測腦組織Cx43、Cx32蛋白的表達取石蠟組織切片，PBS沖洗5 min×3次，檸檬酸抗原修復(fù)10 min，PBS沖洗5 min×3次，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊血清50 μL封閉內(nèi)源性生物素20 min，甩掉血清后，滴加熒光一抗(按1∶200稀釋)，50 μL/片，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加熒光二抗50 μL/片，37 ℃反應(yīng)2 h，PBS沖洗5 min×3次。切片脫水至透明后封片，熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并采集圖像，用Image Pro Plus 6.0對蛋白表達情況進行定量分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠神經(jīng)功能評分的變化，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠炎癥浸潤、髄鞘脫失評分和腦組織中Cx43、Cx32蛋白表達的變化。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能狀況的比較結(jié)果見表1。參與造模的大鼠均表現(xiàn)出EAE疾病發(fā)展進程，神經(jīng)功能評分增加(P<0.05)；與模型組比較，苦參素預(yù)防組和治療組大鼠的神經(jīng)功能評分均降低(P<0.05)，且苦參素預(yù)防組表現(xiàn)出的發(fā)病延遲和癥狀緩解情況優(yōu)于治療組，預(yù)防組和治療組大鼠的神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠腦組織病理學(xué)表現(xiàn)LFB和HE染色結(jié)果(圖1，表2)顯示，正常組大鼠腦組織髓鞘完整，幾乎無炎性細胞浸潤，無空泡狀改變；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)了大小不等的脫髓鞘區(qū)域，有大量的炎性細胞浸潤，并且出現(xiàn)空泡狀改變；苦參素預(yù)防組和治療組大鼠腦組織髓鞘脫失和炎性細胞浸潤情況較模型組明顯減輕。與模型組相比，苦參素預(yù)防組與治療組的組織病理學(xué)評分均降低；與苦參素治療組相比，預(yù)防組的組織病理學(xué)評分降低。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較

A:正常組；B：模型組；C：苦參素治療組；D：苦參素預(yù)防組；1：LFB染色；2：HE染色

表2 各組大鼠腦組織病理學(xué)表現(xiàn)的比較

2.3各組大鼠腦組織中Cx43、Cx32蛋白表達的比較免疫熒光單標(biāo)染色結(jié)果(圖2，表3)顯示，與正常組比較，模型組大鼠腦組織中Cx43蛋白表達水平升高，Cx32蛋白表達水平降低；與模型組相比，苦參素預(yù)防組與治療組大鼠Cx43蛋白表達水平降低，Cx32蛋白表達水平升高；苦參素預(yù)防組Cx43蛋白表達水平低于治療組，而Cx32蛋白表達水平高于治療組。

A:正常組；B：模型組；C：苦參素治療組；D：苦參素預(yù)防組；1：Cx43;2：Cx32

表3 各組大鼠腦組織中Cx43、Cx32蛋白表達的比較

3 討論

GJ是相鄰細胞膜對應(yīng)面上一對接合體構(gòu)成的通道，是細胞間唯一能直接交換物質(zhì)和信息的通道，主要功能是通過電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)兩種方式，介導(dǎo)細胞間電和化學(xué)信號的傳遞，允許離子(Ca2+、Na+、K+)、谷氨酸(Glu)、谷胱甘肽、環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)、ATP等小分子通過[12]，在細胞新陳代謝、增殖和分化、轉(zhuǎn)運能量、維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[13]等多個方面具有重要作用。GJ的開閉受多種因素調(diào)控，如pH值、Ca2+濃度、膜電位、生長因子和蛋白激酶數(shù)量等[14]；病理情況下，如腦缺血、炎癥、細胞外低鈣時，GJ開放增多，可引起靜息膜電位紊亂、ATP和Glu等有害物質(zhì)釋放、水分?jǐn)z取增加，從而導(dǎo)致細胞水腫破裂等[15]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，EAE發(fā)生后GJ開放增多，提示GJ在神經(jīng)元和髓鞘損傷中起關(guān)鍵作用。Cx是GJ的構(gòu)成蛋白，EAE發(fā)生后，Cx43表達增加，Cx32表達降低[16]，對Cx功能的進一步研究，有可能對MS的預(yù)防和治療提供一個新的方向。

本課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)，苦參素能升高Wistar大鼠血清中IL-4、IL-5和IL-10等細胞因子的表達，提示苦參素可能通過調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮防治EAE的作用。Kan等[10]發(fā)現(xiàn)苦參素能通過抑制Nogo-A誘導(dǎo)的神經(jīng)再生抑制通路而促進受損髓鞘的再生。最新研究[18]發(fā)現(xiàn)，苦參素能抑制EAE大鼠腦中星形膠質(zhì)細胞增生。星形膠質(zhì)細胞的GJ對維持神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。Cx43是星形膠質(zhì)細胞中含量最多的Cx，由Cx43組成的GJ可調(diào)控細胞內(nèi)外Glu、ATP、K+、H+濃度、轉(zhuǎn)運能量和代謝物質(zhì)、介導(dǎo)自分泌和旁分泌信號[19]。Cx43主要與星形膠質(zhì)細胞激活/增生有關(guān)[20]。Cx32主要表達在少突膠質(zhì)細胞上，在維持髓鞘的結(jié)構(gòu)和功能中起關(guān)鍵作用，主要與脫髓鞘損傷程度有關(guān)[20]，敲除Cx32會導(dǎo)致軸突水腫和嚴(yán)重的脫髓鞘[21]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠腦組織中Cx43的表達水平升高，而Cx32的表達降低，這與Markoullis等[16]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過苦參素治療和預(yù)防后，EAE大鼠神經(jīng)功能評分降低，組織病理學(xué)的結(jié)果也與其一致，炎性細胞浸潤、脫髓鞘現(xiàn)象明顯減少。腦組織中Cx43表達降低，而Cx32的表達升高，提示苦參素可能通過抑制Cx43的表達，改善星形膠質(zhì)細胞GJ的功能，減少Glu、ATP等毒性物質(zhì)的釋放；同時通過上調(diào)Cx32的表達，減輕軸突變性和脫髓鞘程度，進而減輕EAE的神經(jīng)損傷。

綜上所述，苦參素可能通過抑制縫隙連接蛋白Cx43和上調(diào)Cx32的表達，改善EAE的相關(guān)癥狀，減輕腦組織中的炎性浸潤和脫髓鞘程度。