高效液相色譜法測定果汁飲料中安賽蜜

王少偉　張金秋　戚繁　徐春祥

摘 要：建立了果汁飲料中安賽蜜的高效液相色譜測定方法。采用C18色譜柱，以20 mmol·L-1乙酸銨與甲醇（98∶2）為流動相，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，二極管陣列檢測器，檢測波長214 nm。結(jié)果表明：該方法安賽蜜回歸方程線性關(guān)系良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.2%（n=6），回收率在97.5%～99.1%。該方法簡便快速，適用于果汁飲料中安賽蜜的檢測。

關(guān)鍵詞：果汁飲料;安賽蜜;高效液相色譜法

Abstract：The analysis is performed on a C18 column using 20 mmol·L-1 sodium acetate solution and methanol as the elution. The flow rate is 1.0 mL·min-1， the column temperature is 30 ℃. The detector is DAD， the detection wavelength are at 214 nm The results show that a good linear relationship. The RSD is below 3.2% （n=6）， the average recovery is 97.5%～99.1%.The method is simple， rapid， repeatable and which could be applied for the analysis of additives in Fruit juice beverage.

Key words：Fruit juice beverage; Acesulfame; High performance liquid chromatography

中圖分類號：TS202.3

果汁飲料是由原果汁或濃縮果汁加糖、酸等調(diào)配成的風(fēng)味飲品[1]。近年來，隨著消費(fèi)者消費(fèi)能力的提高，消費(fèi)者對果汁飲品的營養(yǎng)價(jià)值與安全性更加重視。我國果汁飲品生產(chǎn)工藝多采用安賽蜜作為甜味劑[2]。安賽蜜是一種人工合成甜味劑，具有在人體內(nèi)不代謝、不吸收、對熱和酸穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。但是過量食用含合成甜味劑的食品以及含合成甜味劑超標(biāo)的食品會對人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害[3-6]。研究果汁飲料中安賽蜜的測定方法，對提高我國果汁飲料質(zhì)量有著重要的意義。

目前我國果汁飲料中安賽蜜的檢測依據(jù)是

GB/T 5009.140-2003《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》。日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)中前處理方法對果汁中色素和蛋白質(zhì)不能有效進(jìn)行去除。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的流動相配制過于復(fù)雜，不適用于市面上主流高效液相色譜儀的操作。本研究針對果汁飲料基質(zhì)采用蛋白沉淀劑+C18固相萃取前處理法，以甲醇-乙酸銨作為流動相，紫外可變波長檢測，方法快速準(zhǔn)確，檢出限能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）儀器。高效液相色譜儀，電子天平，超純水儀。

（2）試劑。甲醇（HPLC，TEDIA），20 mmol·L-1乙酸銨溶液，亞鐵氰化鉀溶液，乙酸鋅溶液。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL容量瓶中，用水配制1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。再用水稀釋成

0.001 mg·mL-1、0.005 mg·mL-1、0.010 mg·mL-1、

0.020 mg·mL-1、0.050 mg·mL-1、0.100 mg·mL-1和

0.200 mg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度由低到高進(jìn)樣，以待測物質(zhì)峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3 樣品處理

（1）方法1（國標(biāo)方法）。吸取2 g樣品，加水約20 mL混勻后，離心15 min（8 000 r·min-1），上清液全部轉(zhuǎn)入中性氧化鋁柱，待水溶液流至柱表面時(shí)，用流動相洗脫。收集洗脫液25 mL，混勻后，超聲脫氣，此液作HPLC分析用。

（2）方法2。吸取2 g樣品于50 mL 離心管中，加水15 mL，50 ℃超聲30 min。加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入2 mL乙酸鋅溶液，搖勻，在

8 000 r·min-1條件下，離心5 min。將上清液完全轉(zhuǎn)移至C18固相萃取小柱中，待水溶液流至柱表面時(shí)，用流動相洗脫。收集洗脫液25 mL，混勻后，超聲脫氣，經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（symmetry shield RP18， 5μm，4.6 mm×250 mm）;流動相為20 mmol·L-1乙酸銨∶甲醇=98∶2;流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量5 μL;柱溫30 ℃;檢測波長214 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

方法1為GB/T 5009.140-2003規(guī)定的前處理方法。采用該前處理方法，大批量進(jìn)樣時(shí)，會出現(xiàn)色譜柱柱效降低，拖尾嚴(yán)重等問題。原因可能是該方法未能有效去除果汁飲料中的蛋白質(zhì)與色素等大分子物質(zhì)。這些物質(zhì)進(jìn)入色譜柱后，會堵塞柱頭，影響色譜柱壽命。本實(shí)驗(yàn)采用方法2前處理方式，先用蛋白沉淀劑沉淀果汁飲料中蛋白質(zhì)，再經(jīng)過C18小柱去除樣液中色素及大分子物質(zhì)。經(jīng)試驗(yàn)比較兩種前處理方法樣品中安賽蜜測定結(jié)果無明顯差異（見表1），檢出量結(jié)果偏差1.8%。樣品經(jīng)方法2前處理后，樣液雜質(zhì)較少，實(shí)驗(yàn)耗材色譜柱壽命延長。

2.2 流動相及洗脫條件的優(yōu)化

GB 5009.140-2003《飲料中乙?；前匪徕浀臏y定》中規(guī)定的流動相為0.02 mol·L-1硫酸銨（740～800）+甲醇（170～150）+乙腈（90～50）+10%硫酸（1%）。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該流動相配制較復(fù)雜，強(qiáng)酸性物質(zhì)（硫酸）會嚴(yán)重?fù)p傷色譜柱。因此，本實(shí)驗(yàn)采用流動相為20 mmol·L-1乙酸銨（A相）、甲醇（B相）。

研究中分別比較了流動相比例A∶B=90∶10與A∶B=98∶2兩種比例條件下，果汁飲料中安賽蜜的分離效果。圖1、圖2為A∶B=90∶10時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖，安賽蜜在A∶B=90∶10條件下，出峰時(shí)間為5.78 min左右。

圖3、圖4為A∶B=90∶10時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的光譜圖，圖4表明：A∶B=90∶10時(shí)，果汁飲料目標(biāo)峰在202.07 nm處有較大吸收，與圖3安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖有顯著差異。分析可能是色譜峰中包含其他的雜質(zhì)，存在共溶出現(xiàn)象。圖5為流動相比例A∶B=98∶2時(shí)樣品色譜圖，結(jié)果表明，在流動相A∶B=98∶2時(shí)，果汁飲料中安賽蜜與干擾物分離度較好。因此，流動相選用20 mmol·L-1乙酸銨（98%）、甲醇（2%）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限標(biāo)準(zhǔn)系列物質(zhì)按儀器設(shè)定條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的線性回歸方程，同時(shí)以3倍信噪比計(jì)算安賽蜜的檢出限，具體結(jié)果見表2，安賽蜜在1～200 μg·mL-1濃度內(nèi)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以市場上常見不含安賽蜜的果汁飲料樣品為代表樣品，分別按高、中、低3個(gè)濃度添加安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品，按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行平行6次分析，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本文建立了一種測定果汁飲料中安賽蜜的高效液相法。樣品前處理采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為蛋白沉淀劑，再通過C18小柱去除果汁飲料中色素以及大分子雜質(zhì)，回收率高。方法耗時(shí)短，操作簡單，適用于大量樣品的快速檢驗(yàn)，可作為國家標(biāo)準(zhǔn)方法的補(bǔ)充進(jìn)行推廣。

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作者簡介：王少偉（1987—），男，碩士，工程師;研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。