李 紅 尹學(xué)智 徐改改 申瑞玲 畢艷蘭 呂喜麗

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鄭州 450000) (河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院2，鄭州 450000)

磷脂是脂肪酸甘油酯通過磷酸根與膽堿、膽胺等不同基團(tuán)相連接而成的化合物[1]，其結(jié)構(gòu)具有由磷酸相連的取代基團(tuán)構(gòu)成的親水頭和由脂肪酸鏈構(gòu)成的疏水尾，是一種重要的兩親物質(zhì)，具有乳化、潤濕、分散、增溶等特性[2]；此外，磷脂含有豐富的不飽和脂肪酸、膽堿、肌醇等營養(yǎng)成分，是一種天然的營養(yǎng)強(qiáng)化劑[3]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料等工業(yè)[4]。然而，天然磷脂分子中的多不飽和脂肪酸對磷脂的穩(wěn)定性造成一定的威脅，易被氧化，使磷脂顏色加深，物理、化學(xué)性質(zhì)及營養(yǎng)價值也發(fā)生一定變化，很大程度上會限制磷脂的應(yīng)用[5]。因此，對磷脂進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，改變磷脂的脂肪酸組成，以提高磷脂的氧化穩(wěn)定性，改善磷脂的功能性質(zhì)，尤為重要。

酯交換是一種重要的磷脂結(jié)構(gòu)修飾方法，不但能改變磷脂的脂肪酸組成，還可以避免反式脂肪酸的生成。磷脂酯交換反應(yīng)主要有化學(xué)法和酶催化法兩種，化學(xué)法由于使用強(qiáng)堿(如甲醇鈉[6])作為催化劑，沒有專一性，Sn-1和Sn-2位的脂肪酸都會發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)溫度較高，常有副反應(yīng)發(fā)生；而酶法[7, 8]催化磷脂酯交換具有選擇性高，副反應(yīng)少，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，近年來深受國內(nèi)外學(xué)者的重視。

目前，有關(guān)酶法酯交換在磷脂中引入飽和脂肪酸的研究多以棕櫚酸、癸酸、月桂酸等飽和酸或飽和脂肪酸的甲酯為?；w與卵磷脂進(jìn)行酸解反應(yīng)或酯交換反應(yīng)。班婷婷等[9]以 Lipozyme TLIM 為工具酶，在正己烷體系中催化醇溶性大豆磷脂與棕櫚酸的酸解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在最佳反應(yīng)條件下得到的磷脂中的棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.6%，且酯交換后的磷脂氧化穩(wěn)定性得到提高。Ghosh[10]采用微生物脂肪酶催化癸酸、月桂酸及豆蔻酸的甲酯與卵磷脂的酯交換反應(yīng)，結(jié)果表明，酯交換反應(yīng)中脂肪酸的結(jié)合程度與其分子質(zhì)量緊密相關(guān)，脂肪酸的分子質(zhì)量越大，與磷脂的結(jié)合程度越高；并發(fā)現(xiàn)酯交換反應(yīng)提高了卵磷脂的表面活性。

圖1 脂酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)

磷脂酶A1專一性催化天然磷脂的Sn-1 位?；乃夂王ソ粨Q反應(yīng)，生成 Sn-1溶血磷脂或Sn-1位脂肪酸酯交換改性磷脂。朱姍姍[11]在正己烷體系中，采用10%的固定化磷脂酶A1催化摩爾比為 1∶5的大豆磷脂與共軛亞油酸乙酯的酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)55 ℃下，72 h后，生成的改性磷脂中共軛亞油酸c9,t11-CLA 和t10,c12-CLA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 15.04%和 14.54%。馬彥慶等[8]報道了正己烷體系中，固定化磷脂酶 A1催化磷脂酰膽堿(PC) 富集物和二十二碳六烯酸(DHA) 濃縮液的酯交換反應(yīng)，得到了DHA含量為 17.7 mg/g PL的磷脂。

然而，脂肪酸或脂肪酸甲酯均是以甘三酯為原料制得的，如能以飽和脂肪酸甘三酯作為?；w，不僅能得到飽和脂肪酸含量高的磷脂，還能降低成本。目前，僅楊力會等[12, 13]報道了脂肪酶Lipozyme RM IM催化的棕櫚硬脂與大豆卵磷脂的酯交換的反應(yīng)，其他飽和脂肪酸甘三酯作為?；w的酯交換反應(yīng)鮮見報道。而全氫化大豆油棕櫚酸和硬脂酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過99%，可作為磷脂酯交換反應(yīng)良好的?；w。

此外，文獻(xiàn)報道的磷脂酯交換反應(yīng)基本都以價格昂貴的卵磷脂為底物，大豆粉末磷脂雖是卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂等組成的混合物，但對于研究磷脂與甘三酯的酯交換反應(yīng)，改變磷脂的脂肪酸組成，大豆粉末磷脂作為底物已足夠滿足需要，且價格相對卵磷脂便宜很多，增加了工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。

本實驗研究了脂酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)(如圖1)，考察了酶的種類、加酶量、底物摩爾比、反應(yīng)時間、溫度等因素對酯交換反應(yīng)的影響，確定了合成改性磷脂的最佳工藝，為改性磷脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉末磷脂、全氫化大豆油、磷脂酶A1、脂肪酶NOVO435。

正己烷、硫代硫酸鈉、碘化鉀、一氯化碘、環(huán)己烷、冰乙酸、濃鹽酸、95%乙醇、甲醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硼酸、酚酞、淀粉、無水碳酸鈉、重鉻酸鉀，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZRD-1熔點儀，DGX-9234B-2型電熱恒溫干燥箱， RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-Ⅲ循環(huán)水泵，TGL-16H高速離心機(jī)，TDL-80-2B 低速離心機(jī)，C10-W12P恒溫水浴磁力攪拌器，HGA-5L空氣發(fā)生器，GHL-300氫氣發(fā)生器，Agilent 6890N型氣相色譜儀，BGZ-240真空干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 酶催化酯交換反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取一定量的大豆粉末磷脂和全氫化大豆油于50 mL錐形瓶中，加入一定的正己烷溶解(大豆粉末磷脂的濃度為0.2 g/mL)，加入一定量的酶，于一定溫度下在速率為100 r/min的磁力攪拌器中反應(yīng)，一定時間后，移入50 mL離心管，并用正己烷沖洗錐形瓶3次，保證磷脂被完全收集，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min，溫度為25 ℃下離心10 min，分出上清夜至100 mL圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待正己烷完全蒸出后，分3次加入30 mL丙酮，溶出未反應(yīng)的全氫化大豆油，并將固液混合物全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min，溫度為25 ℃下離心10 min，傾去上清液，重復(fù)用20 mL丙酮洗滌、離心3次，刮出下層物質(zhì)置于已稱重培養(yǎng)皿中，在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，稱重，計算改性磷脂的產(chǎn)率，并測定所得樣品的碘值、熔點及脂肪酸組成。

1.3.2 碘值測定

碘值測定：參照GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》。

1.3.3 熔點的測定

參照GB/T 12766—2008《動物油脂 熔點測定》，采用熔點儀對產(chǎn)品進(jìn)行熔點測定。

1.3.4 磷脂脂肪酸組成測定

參照GB 5009.168—2016 《食品中脂肪酸的測定》。

氣相色譜條件：色譜柱型號(BPX-70毛細(xì)管脂肪酸分析柱)，長度(120.0 m) ，內(nèi)徑(250 μm)，膜厚(0.50 μm)，進(jìn)樣口溫度(210 ℃)，柱溫(180 ℃)，檢測器(FID)，空氣流速(400 mL/min)，氫氣流速(30 mL/min)，氮氣流速(0.6 mL/min)，檢測器溫度(300 ℃)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶催化大豆粉末磷脂酯交換反應(yīng)的單因素實驗

2.1.1 酶的選取

分別選用0.28 g磷脂酶A1和NOVOzyme435(20%以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))作為催化劑，催化50 ℃下，1.8 g全氫化大豆油與1.4 g大豆粉末磷脂(二者摩爾質(zhì)量比為3∶1)在正己烷體系中(磷脂濃度為0.20 g/mL)的酯交換反應(yīng)，18 h后測定酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率，結(jié)果如表1所示。與NOVOzyme435相比，磷脂酶A1催化得到改性磷脂的碘值較低，產(chǎn)率較高，因此，選用磷脂酶A1作為催化磷脂酯交換反應(yīng)的催化劑。

表1 不同酶催化下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

2.1.2 溫度對酯交換反應(yīng)的影響

分別在45、50、55、60、65 ℃下，摩爾質(zhì)量比為3∶1的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的正己烷溶液(磷脂濃度為0.20 g/mL)，在20%磷脂酶A1(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))催化下反應(yīng)18 h后測得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率作為考察指標(biāo)，對溫度作圖，見圖2。

圖2 不同反應(yīng)溫度下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

由圖2數(shù)據(jù)所知，溫度對酶的影響較大，當(dāng)溫度從45 ℃升至50 ℃時，產(chǎn)物的碘值逐漸降低、產(chǎn)率升高，表明磷脂酶A1催化酯交換反應(yīng)的速率在提升；當(dāng)反應(yīng)溫度高于50 ℃時，產(chǎn)物的碘值開始不斷升高、產(chǎn)率下降，表明酶催化效率開始降低。在50 ℃時產(chǎn)物的碘值最低，產(chǎn)率最高，原因可能是磷脂酶催化的酯交換反應(yīng)為界面反應(yīng)，在油水界面，酶與磷脂結(jié)合而發(fā)生水解，溫度升高使得體系的黏度降低、傳質(zhì)阻力減小、擴(kuò)散系數(shù)增大, 增加了底物分子與酶活性中心位點結(jié)合的幾率，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行；而溫度過高會導(dǎo)致酶蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變而失活，以及可能會導(dǎo)致熱敏性磷脂變性[14]，所以該反應(yīng)溫度宜選50 ℃。

2.1.3 時間對酶法酯交換反應(yīng)的影響

在50 ℃下，摩爾質(zhì)量比為3∶1的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的正己烷溶液(磷脂濃度為0.20 g/mL)，在20%磷脂酶A1(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))催化下，分別反應(yīng)6、12、18、24、30 h后測得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率見圖3。

圖3 不同反應(yīng)時間下酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率

由圖3數(shù)據(jù)可知，隨著反應(yīng)時間的延長，酯交換程度不斷增加，產(chǎn)物的碘值不斷降低，產(chǎn)率逐漸上升，但當(dāng)反應(yīng)時間超過18 h后，產(chǎn)物碘值出現(xiàn)上升趨勢，而產(chǎn)率也開始下降。反應(yīng)時間為18 h時，產(chǎn)物碘值最低，產(chǎn)率比反應(yīng)24 h稍低。究其原因可能是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水解產(chǎn)物溶血磷脂增加，與全氫化大豆油反應(yīng)速度加快[15]；然而，反應(yīng)時間繼續(xù)延長，磷脂會有一定程度的氧化，同時，副反應(yīng)也在不斷的進(jìn)行，導(dǎo)致得率降低。因此，反應(yīng)時間選取18 h比較合適。

2.1.4 底物的摩爾質(zhì)量比對酶法酯交換反應(yīng)的影響

分別稱取不同摩爾質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂于正己烷中(磷脂濃度為0.20 g/mL)，在20%磷脂酶A1(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))催化下，于50 ℃下，反應(yīng)18 h后測得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率見圖4。

圖4 不同底物摩爾比下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

由圖4數(shù)據(jù)可知，隨著底物比不斷增大，產(chǎn)物的碘值逐漸減小、產(chǎn)率上升，但當(dāng)全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的摩爾比達(dá)到4∶1后，產(chǎn)物碘值出現(xiàn)升高、產(chǎn)率下降的趨勢。在底物摩爾質(zhì)量比(全氫化大豆油：大豆粉末磷脂)為3∶1時產(chǎn)物的碘值最低，產(chǎn)率比4∶1時稍低?？赡芤驗殡S底物比不斷增大，磷脂與全氫化大豆油的接觸機(jī)會增大，反應(yīng)速率加快；然而，酶的添加量一定，隨全氫化大豆油量的增加，磷脂相對量有所降低，從而影響反應(yīng)效率，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率又降低。因此底物的摩爾質(zhì)量比(全氫化大豆油：大豆粉末磷脂)選3∶1。

2.1.5 酶的添加量對酶法酯交換反應(yīng)的影響

分別選用5%、10%、15%、20%、25%(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))的磷脂酶A1為催化劑，催化50 ℃下、摩爾質(zhì)量比為3∶1的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的正己烷溶液(磷脂濃度為0.20 g/mL)的酯交換反應(yīng)，18 h后測得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率見圖5。

圖5 不同酶添加量下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

由圖5數(shù)據(jù)可知，隨著酶添加量的增加，產(chǎn)物碘值逐漸降低、產(chǎn)率升高；當(dāng)酶添加量增至20%時，碘值最低；再繼續(xù)增大時碘值開始升高、產(chǎn)率也有所降低。原因可能是隨著酶添加量的不斷增大，更多的酶分子到達(dá)反應(yīng)界面參與反應(yīng)，進(jìn)而反應(yīng)產(chǎn)率提高；當(dāng)酶的添加量增大到一定值以后，酶與底物結(jié)合的活性位點達(dá)到飽和，會有一部分酶無法發(fā)揮作用，使得反應(yīng)趨于平衡[16]，然而，隨反應(yīng)時間不斷延長，催化效果會有所下降。因此，酶的添加量在20%較為適宜。

2.2 正交實驗

一個反應(yīng)的發(fā)生并不是單一因素決定，而是多個因素共同作用的結(jié)果，因此，非常有必要利用正交實驗綜合考察反應(yīng)溫度、時間、底物摩爾比和酶的添加量等因素對酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)的影響。

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，分別選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、底物摩爾比和酶添加量4個因素，每個因素分別選取3個水平(因素及水平表見表2)，建立L9(43)的正交實驗。以產(chǎn)物的碘值和產(chǎn)率為指標(biāo)，確定大豆粉末磷脂與全氫化大豆油酯交換反應(yīng)的最佳條件。結(jié)果見表3。

表2 正交實驗因素及水平

表3 大豆粉末磷脂與全氫化大豆油酯交換反應(yīng)正交實驗結(jié)果

由表3可知，以碘值為衡量指標(biāo)，反應(yīng)溫度和底物比對大豆粉末磷脂與全氫化大豆油酯交換反應(yīng)影響都很大，其次是酶添加量，影響最小的是反應(yīng)時間，影響反應(yīng)因素主次依次為A=C>D>B，最優(yōu)反應(yīng)條件為A3B2C1D1，即反應(yīng)溫度為55 ℃、反應(yīng)時間24 h、底物摩爾比為2∶1、加酶量為15%；以產(chǎn)率為衡量指標(biāo)，反應(yīng)溫度對酯交換反應(yīng)影響最大，其次是酶的添加量，再者為反應(yīng)時間，最后為底物比，影響反應(yīng)因素主次依次為A>D>B>C，最優(yōu)反應(yīng)條件為A2B2C3D3，即反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時間24 h、底物摩爾比為4∶1、加酶量為25%。

2.3 最優(yōu)條件的驗證

分別按照最優(yōu)反應(yīng)條件1(反應(yīng)溫度為55 ℃、反應(yīng)時間24 h、底物摩爾比為2∶1、加酶量為15%)和最優(yōu)反應(yīng)條件2(反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時間24 h、底物摩爾比為4∶1、加酶量為25%)進(jìn)行粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)，處理完畢后得到結(jié)果見表4。

表4 兩種最優(yōu)條件酯交換反應(yīng)結(jié)果

由表4數(shù)據(jù)可以看出，最優(yōu)反應(yīng)條件1得到的酯交換產(chǎn)物的碘值最低，是以碘值衡量得到的最佳反應(yīng)條件。最優(yōu)反應(yīng)條件2得到的酯交換產(chǎn)物的碘值52 gI/100 g雖比最優(yōu)條件1得到產(chǎn)物碘值51 gI/100 g稍高，但是產(chǎn)率卻比最優(yōu)條件1高出很多，因此選擇最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時間24 h、底物摩爾比為4∶1、加酶量為25%。

2.4 酯交換反應(yīng)前后磷脂的熔點及碘值

酯交換反應(yīng)前后大豆粉末磷脂、全氫化大豆油和按最優(yōu)方法得到的改性磷脂的碘值及熔點見表5所示。由表5可知，改性磷脂的碘值由原料大豆粉末磷脂的89 gI/100 g降至改性磷脂的52 gI/100 g，說明改性磷脂脂肪酸的雙鍵數(shù)目減少，大豆粉末磷脂中的不飽和脂肪酸與氫化大豆油中的飽和脂肪酸發(fā)生了酯交換反應(yīng)；此外，與原料磷脂的熔點相比，改性磷脂的熔點也發(fā)生了比較大的變化。

表5 原料大豆粉末磷脂、全氫化大豆油和改性磷脂的碘值及熔點

2.5 酯交換反應(yīng)前后磷脂的脂肪酸組成

全氫化大豆油及酯交換反應(yīng)前后磷脂經(jīng)氣相色譜分析，并按校正峰面積歸一化法計算得到相應(yīng)的脂肪酸組成如表6所示。

表6 氫化大豆油、大豆粉末磷脂及改性磷脂的脂肪酸組成(面積歸一法)/%

從表6可見，全氫化大豆油主要由硬脂酸、棕櫚酸和山崳酸組成。大豆粉末磷脂主要由亞油酸、棕櫚酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸和山崳酸組成。

與原料大豆粉末磷脂相比，酯交換改性磷脂中飽和脂肪酸—硬脂酸的含量明顯增加，約為原料磷脂的9倍，棕櫚酸的含量稍有增加，山崳酸的含量卻有所降低；而不飽和脂肪酸含量大幅降低，亞油酸和亞麻酸的含量降低了一半，油酸含量也降低了30%左右。脂肪酸組成的變化同樣說明了在磷脂酶A1作用下，全氫化大豆油與大豆粉末磷脂發(fā)生了酯交換反應(yīng)，得到了不飽和脂肪酸含量降低的改性磷脂。

3 結(jié)論

研究正己烷體系中，酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)，考察了不同條件對酯交換反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在25%磷脂酶A1催化下，摩爾比為4∶1的全氫化大豆油和大豆粉末磷脂的正己烷溶液，在50 ℃下反應(yīng)24 h后，得到碘值為52 g/100 g、產(chǎn)率為72.9%、熔點為110.5～117.3 ℃的改性磷脂。

酯交換改性磷脂的飽和脂肪酸—硬脂酸的含量明顯增加，約為原料磷脂的9倍，而不飽和脂肪酸含量大幅降低，亞油酸及亞麻酸的含量降低了近一半，油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低了30%左右，說明在磷脂酶A1作用下，全氫化大豆油與大豆粉末磷脂發(fā)生了酯交換反應(yīng)，得到了不飽和脂肪酸含量降低的改性磷脂，實現(xiàn)了大豆粉末磷脂的結(jié)構(gòu)修飾。