植物精油對土壤修復(fù)和梨苗生長的影響

錢嘉怡 陳劍 張靜 劉曉 王春雷

摘要：植物精油是植物次級代謝產(chǎn)物，被應(yīng)用到了醫(yī)學(xué)、日用化工、食品、養(yǎng)殖等各領(lǐng)域。以施肥過量的土壤和豆梨幼苗為試驗對象，研究不同濃度植物精油在不同處理時間對土壤修復(fù)和梨苗生長的影響，結(jié)果表明：（1）土壤有機碳和總氮含量、有效磷含量、速效鉀含量在施用10%的植物精油后顯著降低，48 h后銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量顯著降低，但施用精油對土壤機械組成和酸堿性沒有明顯改變。（2）梨苗的過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、脯氨酸（Pro）含量、葉綠素含量、根系活力在施用精油后都有顯著的增加，表明使用植物精油后作物抵抗逆境脅迫的能力有所提高，而超氧化物歧化酶（SOD）活性在處理8 d后有所降低，丙二醛（MDA）含量在10%的植物精油處理后先升后降，表明在開始時有一定迫害，但處理8 d后逆境脅迫基本解除。因而，10%的植物精油可以改良鹽漬化土壤，促進梨苗根系生長，還可以提高梨苗抗逆性，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：植物精油;土壤機械組成;豆梨幼苗;抗氧化酶;根系活力;土壤修復(fù);抗逆性

中圖分類號： X53;S661.201 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0142-06

在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化肥農(nóng)藥的長期過量使用導(dǎo)致耕地出現(xiàn)氮磷鉀積累等一系列問題。近年來，可持續(xù)發(fā)展已成為農(nóng)業(yè)發(fā)展主流。修復(fù)土壤并促進作物更好生長已成為農(nóng)業(yè)研究人員需要解決的重要問題。

植物精油的原料一般為芳香植物的葉、根、皮、花和果等，是植物次級代謝產(chǎn)物[1]，被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，近年來，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也被逐漸引入，如植物精油可以作為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑等，也可以用于果蔬保鮮[2]。柑橘類精油主要來源于柑橘類水果的果皮，其主要成分為萜類物質(zhì)、倍半萜烯碳氫化合物及其衍生物等[3]。目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究表明，植物精油中酚類物質(zhì)、萜類物質(zhì)具有抗氧化性、抑菌性等特性。人們在生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，植物精油可以促進作物在施肥過量導(dǎo)致的氮磷鉀積累土壤上生長，但其機制并不清楚。本試驗擬從土壤和作物自身2方面進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗在揚州大學(xué)文匯路校區(qū)內(nèi)于2018年8月至2019年3月進行。

1.2 植物精油來源

本試驗使用的植物精油由10%柑橘精油和90%蒸餾水組成。

1.3 土樣采集與處理

土壤取自揚州大學(xué)園藝試驗站溫室大棚，棚內(nèi)土壤經(jīng)多年栽培，存在明顯鹽漬化特征。去除土壤中的雜草、石塊等雜物后，整地做畦、劃分區(qū)域，形成9個邊長為0.6 m的正方形試驗小區(qū)，各小區(qū)之間設(shè)保護行，其寬度為0.4 m。將126 mL處理液均勻噴施于每個小區(qū)土壤表面。稀釋10倍（10%）的處理液中包含植物精油12.6 mL、蒸餾水113.4 mL，稀釋100倍（1%）的處理液中包含植物精油 1.26 mL、蒸餾水124.74 mL，對照組使用126 mL的蒸餾水。采用完全隨機設(shè)計，每個處理3次重復(fù)。24、48 h后采集土樣，樣品采集深度為0～20 cm。將采集的樣品帶回實驗室，自然風(fēng)干后碾碎，過 1 mm 篩后待用。

1.4 梨苗處理

梨幼苗為砧木豆梨幼苗。豆梨種子采集于揚州大學(xué)果樹實驗室，經(jīng)層積打破休眠后播種于穴盤中，于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行培育，定期澆水，苗期為50～60 d時進行處理。根據(jù)土樣試驗結(jié)果，噴施稀釋10倍（10%）植物精油于穴盤基質(zhì)中，按照“1.3”節(jié)中土壤處理的用量進行噴施，對照噴施蒸餾水。處理后3、8 d進行采樣，測定相關(guān)指標。

1.5 植物精油對土壤的影響

1.5.1 土樣機械組成測定 參照李朝英等的方法[4]，稱取土樣，潤濕后加入分散劑，搖勻加熱，保持沸騰30 min，制備懸浮液，冷卻后定容，使用甲種比重計進行土壤機械組成測定。

1.5.2 土樣pH值測定 參照王赟峰的方法[5]，取土樣，加去二氧化碳的水，1 ∶ 2.5（體積比）混合攪拌靜置后，采用pH值儀測定上清液pH值。

1.5.3 土壤有機碳（SOC）含量測定 參照蔣溢等的方法[6]，向50 mL離心管中加入2 g土壤樣品（約含15 mg碳）和25 mL高錳酸鉀，振蕩1 h后 4 000 r/min 離心5 min，在565 nm處采用分光光度計測定用去離子水稀釋250倍上清液的吸光率，以無土樣的空白組與土壤樣品組的吸光率差值來表示高錳酸鉀濃度的變動，進而計算出氧化的碳量。

1.5.4 土壤總氮（TN）、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的測定 總氮含量的測定采用凱氏定氮法，具體參照文獻[7]。取0.5 g土樣，加入1.7 g混合催化劑，經(jīng)過濃硫酸消煮1 h后生成硫酸銨，通過堿化蒸餾出氨，蒸餾出的氨被硼酸吸收后，用標準酸溶液滴定至終點，計算土壤全氮含量。銨態(tài)氮含量的測定采用納氏試劑比色法，具體步驟參照弓曉峰等的方法[8]。稱取土樣10 g，用20%的NaCl溶液進行溶解，用定性濾紙過濾振蕩后的溶液。取濾液 5 mL，稀釋4倍后與1 mL酒石酸鉀鈉、1.5 mL 20% NaOH混合搖勻，靜置15 min后加入納氏試劑，定容至 25 mL，測定390 nm處吸光值。硝態(tài)氮含量的測定采用紫外分光光度法，具體步驟參照宋歌等的方法[9]。取 2 mol/L 的KCl溶液50 mL，加入5 g土樣，振蕩1 h后靜置5 min，然后過濾。使用分光光度計在 220 nm 和 275 nm 處測定吸光度，計算硝態(tài)氮濃度。

1.5.5 土壤有效磷（AP）和速效鉀（AK）含量測定 配制好Mchlich3浸提液后，按馮艷紅的方法[10]，在三角瓶中裝入2.5 g土樣后，加入M3浸提液 25 mL，經(jīng)過5 min振蕩后進行干過濾。將濾液、水和顯色劑按照1 ∶ 4 ∶ 5（體積比）混勻，經(jīng)過30 min靜置后，使用分光光度計在660 nm處測定吸光度，并計算有效磷含量;濾液通過 2 ∶ 23（體積比）進行稀釋搖勻后，使用火焰光度計測定速效鉀含量。

1.6 抗氧化酶活性測定方法

采用董紅平的方法[11]，并加以改進，制取酶液，置于0～4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法。測定時，調(diào)零試管加20 μL緩沖液遮光處理，對照試管加20 μL緩沖液，測試試管加20 μL酶液。每支試管都加入3 mL的SOD反應(yīng)液，4 000 lx光照下30 min，560 nm處進行比色。1個活力單位用1 g植物鮮質(zhì)量反應(yīng)1 min對NBT光化還原產(chǎn)生50%的抑制來表示[12-13]。

1.6.2 過氧化物酶（POD）活性 使用愈創(chuàng)木酚法，配置反應(yīng)液，在470 nm下測定吸光值，測定時，3 mL 反應(yīng)液中加酶液20 μL，調(diào)零柱改為加20 μL濃度為20 mmol/L的KH2PO4，每次讀數(shù)間隔1 min。1個活力單位用1 min吸光度減少0.01來表示[12，14]。

1.6.3 過氧化氫酶（CAT）活性 利用紫外分光光度法測定CAT活性，以磷酸緩沖液為空白對照，測定波長為240 nm，1個活力單位用1 min吸光度減少0.01定義來表示。

1.7 葉綠素含量的測定方法

采用分光光度法測定葉綠素含量，具體操作借鑒魏曉飛等的方法[15]，通過無水乙醇調(diào)零，使用分光光度計在663、645 nm處測定吸光度，葉綠素a、b的含量按照Aron公式計算。

1.8 根系活力測定方法

根系活力測定的具體步驟參照陳明輝等的方法[16]，取0.1 mol/L pH值為7.5的磷酸緩沖液和0.5%的（2，3，5-三苯基氯化四氮唑TTC）溶液各 5 mL，混勻后將梨幼苗根尖泡入其中，37 ℃恒溫水浴暗反應(yīng)1 h后，立即終止反應(yīng)，終止反應(yīng)可以通過加入2 mL 1 mol/L的H2SO4來完成。紅色部分表示存在活躍的脫氫酶。去除根尖上的水分，取紅色根尖部分加入乙酸乙酯并研磨，將提取液定容至 10 mL，在485 nm處測定吸光值，以乙酸乙酯為空白對照。由TTC標準曲線得TTC還原量。

1.9 丙二醛（MDA）含量的測定方法

按趙華軍的方法[17]測定丙二醛含量。

1.10 脯氨酸含量測定方法

參照黃海霞的方法[18]測定脯氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油對氮磷鉀積累土壤的作用

2.1.1 植物精油對土壤機械組成的影響 土壤物理性質(zhì)主要由土壤的機械組成決定，其中就包括黏粒、粉粒、沙粒占比等。研究結(jié)果顯示，不同精油處理與對照相比，沙粒、粉粒、黏粒3個部分所占比例沒有明顯差異（圖1-A、圖1-B、圖1-C），表明植物精油不能改善土壤機械組成。pH值是土壤重要指標，不同作物生長都有最適pH值范圍。測定結(jié)果表明，經(jīng)過多年耕作后，大棚土壤呈明顯酸性，其pH值在5.8左右。經(jīng)植物精油處理后，土壤pH值無明顯變化（圖1-D），表明植物精油并不能調(diào)整土壤酸堿度。

2.1.2 植物精油對土壤肥力和鹽分含量的影響 由于本研究選擇試驗區(qū)域的土壤氮磷鉀元素積累是由常年施肥不當引起的，為了研究植物精油對土壤的修復(fù)作用，研究了植物精油對該區(qū)域土壤中有機碳（SOC）、總氮（TN）、銨態(tài)氮（NH+4-N）、硝態(tài)氮（NO-3-N）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）含量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，噴施植物精油后，10%植物精油在處理24、48 h后都能顯著降低土壤有機碳含量，但1%精油處理與對照組相比無明顯差異（圖2-A）?？偟恳嘤邢嗤Y(jié)果，10%植物精油在處理24、48 h后都能顯著降低土壤總氮含量，但1%植物精油處理與對照組相比無明顯差異（圖2-B）。進一步細分來看，10%植物精油在處理24 h后，并不能顯著降低銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量;但10%植物精油在處理48 h后，可顯著降低土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量（圖2-C、圖2-D），而土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量在1%植物精油處理作用下與對照組無顯著性差異。此外，10%植物精油在處理24、48 h后能顯著降低土壤有效磷和速效鉀含量（圖2-E、圖2-F）;土壤在1%植物精油處理24 h后，有效磷、速效鉀含量顯著增加，但是在處理48 h后二者含量又有所回落，與對照相比無顯著差異。結(jié)果表明，10%植物精油處理能顯著降低土壤養(yǎng)分和鹽分含量。

2.2 植物精油對梨苗生長的影響

2.2.1 植物精油對梨苗抗氧化酶活性的影響 根據(jù)前期施用植物精油對土壤養(yǎng)分和鹽分含量影響的試驗結(jié)果可知，幾種處理中能夠顯著降低鹽漬化土壤鹽分含量的是10%植物精油處理48 h;將10%植物精油噴施到基質(zhì)中，處理72 h（3 d）和192 h（8 d）后測定梨幼苗抗氧化系統(tǒng)POD、SOD和CAT活性的變化情況。結(jié)果表明，噴施植物精油能夠顯著提高梨苗POD活性，處理3 d后POD活性約為對照組的3.5倍;處理8 d后POD活性為對照組的5.9倍（圖3-A）。SOD活性在噴施3 d后無明顯變化，處理8 d后顯著下降（圖3-B）。CAT活性在噴施3 d后無明顯變化，處理8 d后顯著升高，變化趨勢與SOD活性正好相反（圖3-C）。POD和CAT活性提高，有助于提升植物抗氧化能力。

2.2.2 植物精油對梨苗葉綠素含量的影響 向基質(zhì)中噴施10%植物精油后能夠顯著提高梨苗葉綠素a的含量（圖4-A），處理組葉綠素a的含量約為對照組的2.5倍。葉綠素b含量在噴施植物精油 8 d 后顯著降低（圖4-B）?？?cè)~綠素含量在噴施植物精油3 d后達到最大值，處理8 d后總?cè)~綠素含量略微降低了一些（圖4-C），但仍然顯著高于對照組，約為對照組含量的1.3倍。

2.2.3 植物精油對梨苗損傷情況 為了研究植物精油是否會造成植株損傷，測定了梨苗根系活力及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量。研究發(fā)現(xiàn)，向基質(zhì)中噴施10%植物精油后，梨苗根系活力明顯提高（圖5-A），處理3 d后的根系活力約為對照組的3倍，處理8 d后根系活力約為對照組的4倍，說明植物精油能夠顯著提高梨苗根系活力。MDA是反映細胞膜損傷情況的物質(zhì)，植物精油處理3 d后，幼苗內(nèi)的MDA含量顯著上升（圖5-B），但隨時間的推移，MDA含量恢復(fù)到正常水平。脯氨酸常被植物用來維持細胞滲透壓，抵御外界脅迫。研究表明，在噴施植物精油后，梨苗體內(nèi)脯氨酸含量明顯升高（圖5-C），說明植物精油對梨苗有一定脅迫作用。

3 討論與結(jié)論

土壤機械組成是影響土壤物理性質(zhì)和養(yǎng)分含量的重要因素[18-19]。pH值是土壤重要的化學(xué)指標，是土壤元素存在及有效性的直接影響者[20]。本研究中施用植物精油對土壤機械組成和酸堿度無顯著影響。土壤中的SOC是土壤有機物轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，本試驗顯示，10%植物精油噴施后土壤中的SOC含量顯著下降，這可能因為精油處理后土壤中的SOC易被微生物分解而發(fā)生礦化反應(yīng)[21];另外，試驗過程中使用的是風(fēng)干土，也可能會促進土壤的礦化作用[22-23]。10%植物精油噴施后土壤中總氮含量也顯著降低。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上在施肥中采用土壤全氮、水解氮（包括無機態(tài)氮和一部分易分解的有機態(tài)氮）含量作為土壤供氮能力與水平評估的指標[23]。本試驗的土壤全氮含量超2 g/kg，居全國分級標準的1級，銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的含量之和也超過水解氮一級標準，表明本試驗土壤氮素豐富，且供氮能力較高。土壤中硝態(tài)氮含量降低往往與淋失有關(guān)，土壤中硝態(tài)氮含量越高則氮素淋失的可能性越大[24]，本研究中硝態(tài)氮含量的降低可能是植物精油導(dǎo)致了硝態(tài)氮的淋失。而銨態(tài)氮降低則與氨揮發(fā)有關(guān)[25]，噴施10%植物精油后表層銨態(tài)氮濃度降低，可能是因為10%植物精油促進氨揮發(fā)。因此，噴施10%精油后土壤中氮素含量的降低，可能是由硝態(tài)氮淋失、氨態(tài)氮揮發(fā)共同造成。磷是作物生長的必需元素，影響作物的生長發(fā)育[26]。施用1%精油后，磷含量有所增加，說明低濃度植物精油可有效提升土壤磷含量，其相關(guān)機制還不清楚。目前全國各地普遍存在化肥施用過量的現(xiàn)象，而作物都有其本身的有效磷閾值，土壤中高含量氮磷構(gòu)成農(nóng)田氮磷流失的潛在威脅[27]。本試驗中土壤磷素含量遠超國家分級標準1級的規(guī)定，而土壤磷素的超標，既會造成磷肥資源的浪費，也易引起水體過營養(yǎng)化，污染水環(huán)境。本試驗中土壤速效鉀含量在10%精油處理48 h后降低至 292 mg/kg，仍高于全國分級標準1級的規(guī)定。鉀在酸性條件下易淋失[25]。本試驗的土壤pH值均低于6.0，屬于酸性，因此10%植物精油噴施會降低土壤鉀濃度，但1%植物精油提高土壤速效鉀含量的原因尚不清楚。因此，10%植物精油能有效降低土壤中多種鹽分含量。

SOD、POD與CAT三者協(xié)同抵御活性氧的傷害，植物體氧負離子的清除受到逆境保護酶活性的直接影響，植物細胞膜的穩(wěn)定和正常生理代謝的維持也受其影響[28]。在本研究中，植物精油能夠增強梨幼苗的保護酶系統(tǒng)，提高SOD、POD和CAT的活性，可能會提高梨苗抵抗逆境脅迫的能力。植物精油對POD活性的提升效果顯著，并且隨時間變化POD活性呈現(xiàn)一個上升趨勢;CAT活性在處理8 d后顯著上升;對于SOD活性，10%植物精油對其在初期有一定提升作用，但隨時間推移活性出現(xiàn)下降趨勢。通常情況下，植物體能夠自主清除多余的自由基，但是在逆境脅迫下活性氧含量超過閾值，脂質(zhì)過氧化等導(dǎo)致植物最終受害。脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一是MDA，因此可用MDA含量來反映細胞膜系統(tǒng)受害的程度[29]。在本試驗中，10%植物精油噴施后，梨苗MDA含量表現(xiàn)為先升后降，處理結(jié)束后MDA含量接近對照植株水平，說明植物精油的施用開始對梨幼苗是有一定迫害的，但8 d后對其造成的逆境脅迫基本解除。植物葉綠素主要參與光合作用，本試驗中，10%的植物精油處理后，梨苗葉綠素總量顯著提升，這有利于光合作用中的光吸收。但葉綠素b含量在處理8 d后有一定減少，這可能不利于植物對弱光的利用，對于弱光的吸收能力降低，這也可能是幼苗對逆境的一種生理反應(yīng)，以此緩解傷害[30]。根系是植物與土壤之間的重要連接體，它既是植物正常生長的影響因素，也起到改良土壤的重要作用，并且能夠敏感地反映出周圍環(huán)境的變化。噴施精油后植物根系活力成倍增加，說明根系能很好地吸收精油，并且根系活力的增加代表著植物能更好更快地對環(huán)境改變作出快速反應(yīng)。脯氨酸是植物最有效的滲透調(diào)節(jié)劑之一，是蛋白質(zhì)和細胞膜的穩(wěn)定劑[31]，有利于植物抗逆生理反應(yīng)的調(diào)動[32]。本試驗中，噴施精油后，脯氨酸含量均顯著高于對照，表明噴施精油后，幼苗能更迅速地對脅迫作出反應(yīng)。植物精油的施用對于梨幼苗生長具有良好的作用，有助于提高植物的抗逆性、光合能力及根系活力等。

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