林珉婷，賴璐璐，趙淼，林必瑋，姚香平,3

利用CRISPR/Cas9 AAV系統(tǒng)構(gòu)建紋狀體基因敲除小鼠模型

林珉婷1,2，賴璐璐1，趙淼1，林必瑋1，姚香平1,3

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 300005 2. 福建醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究院，福州 300004 3. 福建省分子神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 300005

原發(fā)性家族性腦鈣化癥(primary familial brain calcification, PFBC)是慢性進(jìn)展性的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病，臨床癥狀主要包括運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知障礙及精神障礙等，其致病機(jī)制尚未完全明確。研究表明是該病最主要的致病基因。由于基因全身性敲除小鼠模型會(huì)導(dǎo)致胎兒生長受限，為更好地研究PFBC發(fā)病機(jī)制，本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了紋狀體基因條件性敲除小鼠模型。首先，針對(duì)基因編碼區(qū)，設(shè)計(jì)3條靶向exon3的sgRNA (single guide RNA)，通過構(gòu)建質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、Surveyor assay等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證sgRNA的活性。其次，選取活性較高的sgRNA重組包裝AAV-Cre病毒，應(yīng)用立體定位將AAV病毒定點(diǎn)注射于小鼠紋狀體。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明設(shè)計(jì)的3條sgRNA均能夠有效地介導(dǎo)Cas9切割靶DNA。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AAV-Cre病毒具有Cre重組酶活性。最后，通過小鼠腦部組織免疫組化、TA-克隆、高通量測序及Western blot方法檢測基因敲除效率，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠紋狀體組織表達(dá)明顯降低。本研究成功設(shè)計(jì)了3條能夠敲除的功能sgRNA，并應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了紋狀體基因條件性敲除小鼠，為研究PFBC的發(fā)病機(jī)制提供了有效的動(dòng)物模型。

CRISPR/Cas9；；sgRNA；基因敲除；小鼠模型

原發(fā)性家族性腦鈣化癥(primary familial brain calcification, PFBC)是以紋狀體、丘腦、小腦、皮層等部位對(duì)稱性鈣化為特征的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病[1]。臨床主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙、精神癥狀、認(rèn)知障礙、癲癇、頭痛等癥狀。目前PFBC發(fā)病機(jī)制尚不明確，且具有高度遺傳異質(zhì)性[2]。迄今為止，已明確有6個(gè)PFBC致病基因：和[3~8]。其中，2基因被認(rèn)為是PFBC最常見的致病基因，該基因編碼III型鈉–磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體2 (PiT2)，突變后嚴(yán)重影響磷的攝取功能，引起細(xì)胞外磷酸根離子聚集，進(jìn)而導(dǎo)致鈣磷沉積[9,10]。雖然已克隆多個(gè)PFBC致病基因，但該病仍缺乏有效的治療手段，具體的發(fā)病機(jī)制及治療方法仍需進(jìn)一步探討。

動(dòng)物模型是模擬疾病表型、研究疾病機(jī)制及探索治療手段的良好工具。為管家基因，在體內(nèi)廣泛表達(dá)?；蚣兒锨贸∈蟊憩F(xiàn)為胚胎生長受限，且部分新生小鼠會(huì)在斷奶前死亡[11,12]。PFBC患者的病理性鈣化可以累及腦區(qū)各個(gè)位置，但是紋狀體是最為常見的受累部位。因此，構(gòu)建紋狀體基因敲除小鼠模型，不但可以解決基因全身敲除小鼠胚胎生長受限的困境，而且能夠特異性地研究紋狀體區(qū)域腦鈣化具體機(jī)制。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于具備效率高、設(shè)計(jì)簡單等優(yōu)勢，是目前最為廣泛運(yùn)用的基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含兩大組分：一是行使剪切功能的Cas9蛋白；另一個(gè)是特異性引導(dǎo)Cas9蛋白至靶DNA序列的sgRNA(single guide RNA)。由于Cas9蛋白分子量較大，且血腦屏障的存在使得Cas9蛋白病毒載體在神經(jīng)系統(tǒng)中不易于表達(dá)。LSL-Cas9-EGFP小鼠是基因、基因敲入小鼠，可以條件性表達(dá)Cas9蛋白和EGFP蛋白[13]。通過向小鼠腦區(qū)或者核團(tuán)注射sgRNA和Cre，可以激活LSL-Cas9- EGFP小鼠表達(dá)Cas9蛋白，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)目的基因的敲除。本研究運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)，基于LSL-Cas9-EGFP小鼠，進(jìn)行紋狀體基因條件性敲除，為PFBC的發(fā)病機(jī)制及藥物研究提供良好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中所用小鼠為條件性表達(dá)Cas9及EGFP蛋白小鼠(LSL-Cas9-EGFP小鼠，B6；129-Gt(ROSA) 26Sortm1(CAG-Loxp-Stop-LoxP-Cas9, -EGFP)Fezh/J)，由美國The Jackson Laboratory實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。AAV病毒表達(dá)載體(60229, AAV:ITR-U6-sgRNA-backbone- pCBh-Cre-WPRE-hGHpA-ITR)購于美國Addgene公司，含Cre位點(diǎn)以及兩個(gè)I酶切位點(diǎn)。Reporter質(zhì)粒(20299, pAAV-EF1a-double floxed-mCherry-WPRE- HGHpA)購于美國Addgene公司，其中兩個(gè)flox序列是反向插入，可條件性表達(dá)紅色熒光蛋白。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存質(zhì)粒px458(Cas9/sgRNA/EGFP共同表達(dá)質(zhì)粒)含I酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。T4 DNA連接酶、I、I等核酸內(nèi)切酶購于美國NEB公司，細(xì)胞株為小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2A細(xì)胞、293T細(xì)胞。

1.2 sgRNA設(shè)計(jì)和寡核苷酸鏈合成

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)sgRNA設(shè)計(jì)原則，使用Zhang lab網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu)對(duì)鼠源基因(Gene ID: 20516)第3外顯子(290~429 bp)設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，選擇敲除效率分?jǐn)?shù)最高的3個(gè)sgRNA (sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3)，具體信息見表1。sgRNA序列若不以G堿基開頭，可添加1個(gè)G堿基以便U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在合成sgRNA時(shí)需在序列里添加5?-cacc-3?和5?-aaac-3? (表1)，使其退火后形成可與I酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的粘性末端。根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，分別為E3F:5?-TGACTCATCATTGG-CACAGG-3?和E3R:5?-TAAGGCTCTTCTTCACGT-GG-3?，擴(kuò)增長度為650 bp。sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3切割后產(chǎn)物大小分別約為297 bp和353 bp、288 bp和362 bp、248 bp和402 bp。

1.3 構(gòu)建Slc20a2基因px458-sgRNA打靶載體

實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體為px458，使用I限制性內(nèi)切酶酶切，37℃水浴1 h，按照膠回收試劑盒說明書回收約9300 bp長度的DNA片段。將合成的sgRNA的上游(F)和下游(R)引物用退火緩沖液稀釋至9 mmol/L，用PCR儀退火，程序?yàn)?5℃ 5 min，72℃ 10 min，37℃ 20 min，即退火為雙鏈DNA，用于后續(xù)連接反應(yīng)。退火后的sgRNA寡核苷酸雙鏈與回收的px458載體片段在T4 DNA連接酶作用下16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，挑取單克隆菌落并提取質(zhì)粒px458-sgRNA1、px458- sgRNA2和px458-sgRNA3，通過一代測序驗(yàn)證將sgRNA序列克隆到px458質(zhì)粒中。

表1 sgRNA序列

合成sgRNA時(shí)需在序列里添加5?-cacc-3?和5?-aaac-3?，以與I酶切位點(diǎn)的粘性末端互補(bǔ)。

1.4 sgRNA活性檢測

將4 μg質(zhì)粒px458-sgRNA用脂質(zhì)體lipo3000 (L3000-015，美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染至匯合度達(dá)到60%~80%的N2A細(xì)胞，對(duì)照為轉(zhuǎn)染px458空載質(zhì)粒(空白對(duì)照)，混勻，置于5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞DNA。棄除細(xì)胞培養(yǎng)基，加1 mL PBS將細(xì)胞吹散，收于1.5 mL EP管中，12,000 r/min 離心1 min，去上清，留沉淀。用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)提取基因組DNA。然后吸取2 μL DNA作為模板，引物為E3F和E3R，用KOD酶(TOYOBO公司，日本)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min。用純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行變性、復(fù)性，其程序?yàn)?5℃ 5 min，在95℃降至85℃期間，以每秒2℃退溫，在85℃降至25℃期間，以每秒0.1℃退溫，最后產(chǎn)物于4℃放置10 min。按照Surveyor突變檢測試劑盒(Transgenomic公司，美國)，分別加入1 μL Surveyor Nuclease S、1 μL Surveyor Enhancer S、0.15 mol/L MgCl22 μL和20 μL DNA，混勻后42℃放置1 h，加入1/10體積的終止液混勻后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。根據(jù)編輯效率公式fcut = (b+c)/(a+b+c)和indel(%)=100×(1?(1?fcut))進(jìn)行計(jì)算來評(píng)估CRISPR/Cas9的編輯效率。

1.5 構(gòu)建AAV-sgRNA-Cre載體及其Cre重組酶活性驗(yàn)證

AAV-Cre病毒表達(dá)載體(60229，美國Addgene公司)[13]，使用I限制性內(nèi)切酶酶切，37℃水浴1 h，按照膠回收試劑盒說明書回收約6400 bp長度的DNA片段。將篩選出活性最高的sgRNA退火后(方法見1.3)與酶切回收的AAV病毒表達(dá)載體片段連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，挑取單克隆菌落并提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，驗(yàn)證sgRNA序列重組到AAV-Cre載體上。將重組后的AAV-Cre質(zhì)粒和紅色熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒(AAV-double-floxed-mcherry)共轉(zhuǎn)檢測Cre重組酶活性。實(shí)驗(yàn)分成5組，分別為轉(zhuǎn)染Cre-GFP質(zhì)粒(陽性對(duì)照)、轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒(報(bào)告質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染AAV-Cre質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)、共轉(zhuǎn)陽性對(duì)照和報(bào)告質(zhì)粒以及共轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)組和報(bào)告質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前24 h，消化293T細(xì)胞鋪板24孔板，每孔接種細(xì)胞1×105個(gè)。轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭繛? μg，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectin 3000。轉(zhuǎn)染后6 h進(jìn)行細(xì)胞換液，棄去培養(yǎng)盤中原有培養(yǎng)基，加入0.5 mL完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后觀察熒光，進(jìn)行拍照。將重組后的AAV-Cre由上海泰廷生物科技有限公司進(jìn)行病毒包裝、純化和濃縮。

1.6 立體定位法注射AAV-sgRNA-Cre病毒

LSL-Cas9-EGFP成年鼠隨機(jī)分為GFP病毒注射組(CON組)和AAV-Cre病毒注射組(KO組)。用戊巴比妥鈉60~80 mg/kg腹腔注射麻醉成年小鼠。將小鼠兩側(cè)外耳道及牙齒固定在腦立體定向儀(Stoelting公司，美國)，常規(guī)備皮消毒后進(jìn)行頭部剪毛，剪去表層皮膚暴露前囟并標(biāo)記前囟位置。根據(jù)坐標(biāo)點(diǎn)調(diào)整好鉆孔位置，確立右側(cè)紋狀體坐標(biāo)：前囟后0.46 mm，中線側(cè)旁開2.00 mm，硬膜下4.00 mm。調(diào)整游標(biāo)卡尺對(duì)應(yīng)其坐標(biāo)點(diǎn)，用牙科鉆孔器鉆孔。用微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)進(jìn)針，緩慢注射。注射速度0.2 μL/min，注射病毒量0.5~2.0 μL。注射完畢停10 min后緩慢退針、縫皮、消毒、解除固定。給予光照為小鼠保暖，等待小鼠蘇醒。注射過程及結(jié)束后均需要觀察動(dòng)物的反應(yīng)及有無死亡。注射后1月、2月時(shí)分別處死小鼠，進(jìn)行全腦冰凍切片。注射6月后處死小鼠，提取注射部位的紋狀體組織，留取標(biāo)本。

1.7 免疫組化驗(yàn)證

分別在注射后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦組織。用戊巴比妥鈉60~80 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，固定于平板上。依次打開腹腔、胸腔、暴露心臟，用眼科剪剪破右心耳，用注射針尖刺入左心室。先用50 mL生理鹽水灌注，直至肝臟變白，接著用50 mL的4%多聚甲醛進(jìn)行灌注。待鼠尾巴及身體完全僵硬后，取出小鼠的大腦組織。將取出的大腦組織置于4%多聚甲醛固定24 h，接著用30%的蔗糖脫水，待大腦沉入容器底部行冰凍切片。用冰凍切片機(jī)(Leica公司，德國)進(jìn)行冠狀位切片，切片厚度為40 μL。用GFP、Cre抗體進(jìn)行腦片免疫組化。用封閉液配一抗GFP (1:2000，美國Invitrogen公司)和Cre (1:2000，美國Milipore公司)，4℃孵育一抗過夜。次日用1×PBS輕輕洗滌3次，各5 min。用封閉液配相應(yīng)的二抗，于室溫下避光120 min，1×PBS輕輕洗滌3次。用DAPI (1:5000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)覆蓋細(xì)胞表面，1×PBS洗滌3次。在載玻片上滴一滴封片劑，將爬片的細(xì)胞面扣在封片劑上。于共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國)下觀察，并拍照。

1.8 流式分選富集Slc20a2基因點(diǎn)突變細(xì)胞

取AAV-sgRNA-Cre病毒注射6個(gè)月的LSL-Cas9- EGFP小鼠，用戊巴比妥鈉麻醉處死后斷頸，取出右側(cè)紋狀體。充分剪碎后，加入胰酶消化并吹打數(shù)次。置于37℃ 10 min。待充分消化后，加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)基終止消化，離心1000 r/min 5min。用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀(Beckman公司，美國)篩選帶GFP細(xì)胞。提取篩選后細(xì)胞的基因組，由于組織量較少，需用KAPA快速DNA提取試劑盒(KAPA公司，上海)進(jìn)行DNA提取。Nested-PCR擴(kuò)增獲取基因，第一次擴(kuò)增引物為上述的E3F、E3R。第二次擴(kuò)增引物為F:5?-GTACATTGTCGAT-G-CTCT-CC-3?；R:5?-GAAAGGGTGGCGTTAAACC-TG-3?。第二次擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠電泳，鑒定單一特異性條帶后送公司測序評(píng)估基因編輯效果。測序峰圖上在sgRNA識(shí)別的NGG序列附近如果出現(xiàn)多層套疊峰時(shí)，表明該注射病毒的腦區(qū)發(fā)生基因編輯。將上述檢測到發(fā)生突變的PCR產(chǎn)物連接pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化涂板。培養(yǎng)過夜后，挑單克隆(r1~r7等)進(jìn)行測序鑒定獲得具體的基因編輯后的突變類型。

1.9 高通量擴(kuò)增子測序

取AAV-sgRNA-Cre病毒注射后6個(gè)月的LSL- Cas9-EGFP小鼠，用戊巴比妥鈉麻醉處死后斷頸，取出腦組織。分為左側(cè)大腦半球(自身對(duì)照組)和右側(cè)大腦半球(實(shí)驗(yàn)組)兩個(gè)部分。待充分剪碎后，提取組織DNA，擴(kuò)增獲取基因。第一次擴(kuò)增引物為F1:5?-GCCAGGTGGCTAAGACACTG-3?和R1:5?- CCTTGCTCCGTTGCCTATAC-3?。為進(jìn)行后續(xù)的二代測序，需進(jìn)行二次擴(kuò)增，在引物5?端加接頭。左半球腦組織的第二次擴(kuò)增引物為F2:5?-GAATTCTC-AATGCCGGATCCGCCAGGTGGCTAAGACACTG-3?和R2:5?-GAATTCTGGCGATAGGATCCCCTTGCT-CCGTTGCCTATAC-3?，右半球腦組織的第二次擴(kuò)增引物為F3:5?-GAATTCCAAGCACCGGATCCGCCA-GGTGGCTAAGACACTG-3?和R3:5?-GAATTCTTT-CGACGGGATCCCCTTGCTCCGTTGCCTATAC-3?。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠鑒定單一特異性條帶后送金唯智公司進(jìn)行高通量擴(kuò)增子測序。使用MiSeq平臺(tái)測序DNA文庫混合后，按Illumina MiSeq (Illumina公司，美國)儀器使用說明書進(jìn)行2×250/ 2×250 bp 雙端測序(PE)，由MiSeq自帶的MiSeq Control Software (HCS)+OLB+GAPipeline-1.6讀取序列信息。使用fastp(v0.19.6)軟件的默認(rèn)參數(shù)對(duì)雙端250 bp的測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除測序接頭和過濾低質(zhì)量reads的處理。隨后，根據(jù)樣本的barcode信息對(duì)上一步得到的FASTQ文件(clean reads)進(jìn)行拆分。雙端reads的拼接、比對(duì)以及比對(duì)后結(jié)果的統(tǒng)計(jì)使用CRISPResso2軟件的默認(rèn)參數(shù)完成。

1.10 Western blot檢測

戊巴比妥鈉麻醉分別處死實(shí)驗(yàn)組小鼠(KO組)、對(duì)照組小鼠(CON組)、未注射病毒的空白組小鼠(WT組)。取出右側(cè)紋狀體，充分剪碎后，加入800 μL LBA150裂解緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、150 mmol/L NaCl、0.5% NP40、10% glycerinum、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L Cocktail、1 mmol/L NaF、1 mmol/L Na2NO3)。繼續(xù)研磨至無明顯組織形態(tài)的溶液狀，于冰上裂解30 min。轉(zhuǎn)至新的EP管中，4℃ 12,000 r/min離心30 min。取上清做好標(biāo)記部分保存于–80℃。取適量用于蛋白濃度的測定，按照BCA法(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)蛋白濃度。加入5×SDS Loading Buffer，100℃水浴10 min，14,000 r/min離心5 min ，在12%濃度分離膠的SDS-PAGE膠中電泳。電泳結(jié)束后小心剝下凝膠，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉1 h。4℃孵育一抗(Anti-PiT2，英國Abcam公司)過夜。孵育完畢用TBST洗膜3次，隨后室溫孵育二抗1 h，孵育完畢用TBST洗膜3次，采用ECL法在化學(xué)發(fā)光自顯影儀檢測蛋白條帶并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9打靶載體的活性檢測，篩選高效sgRNA

根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，sgRNA序列選在基因的E3外顯子(圖1 A)，將選擇后的3條sgRNA序列重組至px458質(zhì)粒上。經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建基因的Cas9打靶質(zhì)粒(圖1，B~D)。將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒px458- sgRNA1、px458-sgRNA2和px458-sgRNA3及陰性對(duì)照質(zhì)粒px458轉(zhuǎn)染N2A細(xì)胞，按照 Surveyor突變檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)兩條及以上的新條帶(圖1E)。sgRNA1酶切后的新片段長度預(yù)測約為297 bp和353 bp，sgRNA2約為288 bp和362 bp，sgRNA3約為248 bp和402 bp。根據(jù)文獻(xiàn)[13]的編輯效率公式，對(duì)條帶灰度值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明3條sgRNA均靶向敲除成功，其切割效率分別為52.2%、42.3%和46.8%，其中sgRNA1活性最強(qiáng)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 體外鑒定病毒載體Cre重組酶活性

將篩選出來的sgRNA序列重組至AAV-Cre病毒載體上，通過與紅色熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒(AAV- double-floxed-mCherry)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測其Cre重組酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別單轉(zhuǎn)陽性對(duì)照(Cre-GFP)、報(bào)告質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)組(AAV-Cre)時(shí)均未觀察到紅色熒光，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照分別與報(bào)告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí)均可觀察到紅色熒光，表明實(shí)驗(yàn)組病毒載體具備Cre重組酶活性(圖2)。

圖1 體外打靶效率檢測

A：打靶質(zhì)粒靶點(diǎn)示意圖(靶點(diǎn)序列為紅色標(biāo)記，綠色標(biāo)記的是PAM序列)；B~D：重組測序圖(靶點(diǎn)sgRNA序列為紅色標(biāo)記，綠色標(biāo)記的是px458質(zhì)粒上的sgRNA scaffold序列的部分)；E：打靶效率檢測(a為PCR擴(kuò)增的主帶，大約650 bp；b、c分別是主帶切割形成的預(yù)期大小的條帶)。M為DNA Maker；Mock為空白對(duì)照。

圖2 Cre重組酶活性體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)組與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)可觀察到紅色熒光，表明實(shí)驗(yàn)組AAV-Cre病毒載體具備Cre重組酶活性。標(biāo)尺=100 μm。

圖3 對(duì)照組腦組織免疫熒光圖

上圖為對(duì)照組小鼠在注射AAV-GFP病毒2周后的腦組織免疫熒光圖，注射部位出現(xiàn)綠色熒光。標(biāo)尺=500 μm；下圖為上圖白色小方框的放大示意圖，標(biāo)尺=100 μm。

2.3 紋狀體Slc20a2基因敲除小鼠模型構(gòu)建

取2~3月的LSL-Cas9-EGFP小鼠進(jìn)行右側(cè)紋狀體病毒注射。對(duì)照組注射AAV-GFP病毒，實(shí)驗(yàn)組注射AAV-Cre病毒。在病毒注射后2周、1個(gè)月、2個(gè)月分別進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)AAV-GFP對(duì)照組右側(cè)紋狀體部位出現(xiàn)GFP熒光，彌散分布于紋狀體大部分，蔓延至腦室(圖3)。AAV-Cre實(shí)驗(yàn)組可以觀察到注射部位出現(xiàn)表達(dá)Cre重組酶的紅色熒光和表達(dá)Cas9-EGFP蛋白的綠色熒光(圖4)。在病毒注射后6個(gè)月，提取小鼠的右側(cè)紋狀體組織，進(jìn)行流式分選GFP陽性細(xì)胞。通過PCR擴(kuò)增基因靶點(diǎn)區(qū)域，經(jīng)測序顯示靶點(diǎn)區(qū)域出現(xiàn)套峰(圖5A)，說明基因被編輯。進(jìn)一步進(jìn)行TA克隆觀察到在靶點(diǎn)區(qū)域出現(xiàn)堿基的隨機(jī)插入、缺失或替換，編輯效率約為52.78% (19/36) (圖5B)。通過提取AAV-Cre病毒注射6個(gè)月后的小鼠腦組織，擴(kuò)增靶點(diǎn)區(qū)域后進(jìn)行高通量擴(kuò)增子測序，結(jié)果顯示右側(cè)大腦半球的基因編輯效率為5.99%，明顯高于左側(cè)大腦半球的基因編輯效率(0.36%) (圖5C)。右側(cè)大腦半球在sgRNA結(jié)合的序列附近出現(xiàn)較高頻率的堿基插入、缺失或替換。通過提取實(shí)驗(yàn)組小鼠右側(cè)紋狀體組織，Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(KO)PiT2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(CON)與空白組(WT)，約為對(duì)照組的21% (圖5，D和E)。通過對(duì)AAV-Cre病毒注射6個(gè)月后的小鼠進(jìn)行微型CT檢查和病理切片染色，均未檢測到病理性的腦鈣化結(jié)節(jié)。

圖4 實(shí)驗(yàn)組腦組織免疫熒光圖

上圖為實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射AAV-Cre病毒2周后的腦組織免疫熒光圖，注射部位出現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光。標(biāo)尺=500 μm。下圖為上圖白色小方框的放大示意圖。圖中的箭頭分別表示可觀察到表達(dá)Cre重組酶的紅色熒光、表達(dá)Cas9-EGFP蛋白的綠色熒光以及同時(shí)表達(dá)兩者的熒光。標(biāo)尺=100 μm。

圖5 紋狀體Slc20a2基因敲除驗(yàn)證

A：實(shí)驗(yàn)組小鼠右側(cè)紋狀體組織經(jīng)GFP抗體篩選后的PCR測序圖顯示sgRNA序列附近出現(xiàn)套峰；B：實(shí)驗(yàn)組小鼠右側(cè)紋狀體組織經(jīng)GFP抗體篩選后的TA克隆基因型顯示PAM序列附近堿基的隨機(jī)插入或缺失；C：實(shí)驗(yàn)組左右大腦半球高通量擴(kuò)增子測序結(jié)果比較，右側(cè)大腦半球有更高的基因編輯效率；D：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組小鼠的右側(cè)紋狀體組織PiT2蛋白免疫印跡圖；E：圖D的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。實(shí)驗(yàn)組PiT2蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組、空白組。圖中數(shù)值給出的是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，=3。**：<0.01；***：<0.001；NS表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

目前，有研究報(bào)道關(guān)于基因全身性敲除小鼠模型，表現(xiàn)顱腦鈣化的同時(shí)多合并其他的癥狀，如胚胎生長受限、視神經(jīng)鈣化、腦積水[12,14,15]。推測可能的機(jī)制是純合型–/–的臨床表型比雜合型+/–明顯。作為致病基因?yàn)槌Ｈ旧w顯性遺傳，臨床上除了一例報(bào)道復(fù)合雜合突變的患者臨床癥狀較其父母(均攜帶雜合突變)嚴(yán)重許多外[3]，其余PFBC患者均為雜合突變?；蛑虏〉臋C(jī)制是由于編碼的PiT2突變后降低細(xì)胞對(duì)無機(jī)磷的攝取，推測雜合突變導(dǎo)致單倍體劑量不足而致病。基因作為管家基因，不僅參與大腦的磷代謝過程，在身體其他部位的磷代謝中也起重要作用[16~18]。所以由于基因全身性敲除小鼠模型的局限性，組織特異性的基因敲除小鼠成為研究PFBC的關(guān)鍵。

本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建紋狀體基因敲除小鼠，不僅可以解決全基因敲除小鼠致死或發(fā)育不良的困境，而且能夠特異性地研究紋狀體鈣化的具體機(jī)制。TA克隆的基因型分析發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行切割后，細(xì)胞對(duì)其修復(fù)的過程中導(dǎo)致堿基隨機(jī)的插入或缺失，導(dǎo)致基因突變，從而模擬臨床PFBC的發(fā)病過程。通過對(duì)病毒注射部位行流式分選GFP陽性細(xì)胞，由于可以富集經(jīng)基因編輯的細(xì)胞，編輯效率明顯高于在體的編輯效率。但本研究中的小鼠腦區(qū)基因編輯效率很可能被低估，原因在于病毒的注射部位局限于小鼠的右側(cè)紋狀體組織，而進(jìn)行高通量測序時(shí)采用的樣品為一側(cè)大腦半球。從免疫熒光(圖3，圖4)結(jié)果可以看出病毒高度集中在注射部位，標(biāo)本的選擇是導(dǎo)致基因編輯效率被低估的關(guān)鍵。本研究在體基因編輯效率仍有待于提高，造成這種情況的原因主要是立體定位注射技術(shù)操作難度大、AAV病毒濃度的調(diào)整、AAV病毒Cre重組酶的活性等都是非常重要的因素。

本研究結(jié)合Cre-LoxP系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術(shù)，采用立體定位的方法將AAV-Cre病毒注射至LSL- Cas9-EGFP小鼠的右側(cè)紋狀體。當(dāng)病毒的Cre重組酶表達(dá)后切除CAG啟動(dòng)子下游loxP位點(diǎn)之間的stop序列，激活Cas9-EGFP的表達(dá)。表達(dá)后的Cas9蛋白進(jìn)而在sgRNA的引導(dǎo)下產(chǎn)生基因編輯作用。而常見的Cre-LoxP條件性敲除的Cre重組酶往往被置于某特定基因啟動(dòng)子的下游，目的基因的兩端分別含有一個(gè)loxP位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)較高的組織和細(xì)胞特異性。傳統(tǒng)的條件性敲除往往需要較長的實(shí)驗(yàn)周期、操作復(fù)雜[19]，而本研究的模型構(gòu)建方法設(shè)計(jì)較為巧妙，更為簡便、有效。CRISPR/Cas系統(tǒng)由于脫靶率高在一定程度上限制了其應(yīng)用[20]。結(jié)合AAV-Cre病毒的定點(diǎn)注射在實(shí)現(xiàn)組織特異性敲除的同時(shí)可以有效地避免非靶細(xì)胞編輯的脫靶效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組的PiT2蛋白表達(dá)量比對(duì)照組明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)紋狀體基因被敲減。但半年后對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行病理切片染色或微型CT檢查，未顯示出病理性的腦鈣化結(jié)節(jié)，推測可能的原因是形成病理性的鈣化結(jié)節(jié)需要一定的時(shí)間。有研究表明全基因敲除小鼠需要至少5個(gè)月甚至更長的時(shí)間[21]，且鈣化病灶往往隨著年齡的增長而增大?；蚯脺p后是否出現(xiàn)與疾病相似的表型需要更長的時(shí)間，有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

小鼠紋狀體基因敲除的模型構(gòu)建在國內(nèi)外未見報(bào)道，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合Cre-LoxP系統(tǒng)成功構(gòu)建了基因條件性敲除小鼠，為今后探究PFBC的鈣磷代謝機(jī)制及可能存在的治療研究提供良好的模型。

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Construction of a striatum-specificgene knockout mice model by CRISPR/Cas9 AAV system

Minting Lin1,2, Lulu Lai1, Miao Zhao1, Biwei Lin1, Xiangping Yao1,3

Primary familial brain calcification (PFBC) is a chronic progressive neurogenetic disorder. Its clinical symptoms mainly include dyskinesia, cognitive disorder and mental impairment; and the pathogenesis remains unclear. Studies have shown thatis the most common pathogenic gene of the disease. Since thegene knockout mouse model could result in fetal growth restriction, in order to better understand the pathogenesis of PFBC, the present study used the CRISPR/Cas9 technology to construct a conditional knockout model ofgene in the striatum of mice. First, three sgRNAs (single guide RNAs) were designed to target the exon3 ofgene. The activity of the respective sgRNA was verified by constructing expression plasmids, transfecting cells and Surveyor assay. Second, the SgRNA with the highest activity was selected to generate the recombinant AAV-Cre virus, which was injected into the striatum of mice by stereotactic method.experiments showed that the three sgRNAs could effectively mediate Cas9 cleavage of the respective target DNA. The activity of Cre recombinase of the AAV-Cre was confirmed by immunofluorescence assay. Immunohistochemistry, TA clone, high-throughput sequencing and Western blot were used to detect and evaluate the efficiency ofgene knockout. The results showed that theexpression in the striatum of mice in the experimental group decreased significantly.In this study, three sgRNAs capable of knockout ofwere successfully designed, and the conditional knockout of thegene in the striatum of mouse was successfully established by the CRISPR/Cas9 technology, thereby providing an effective animal model for studying the pathogenesis of PFBC.

CRISPR/Cas9;; sgRNA; gene knockout; mice model

2020-05-18;

2020-08-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81801129)和福建醫(yī)科大學(xué)啟航基金項(xiàng)目(編號(hào)：2017XQ1071, 2018QH2035)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81801129), and Startup Fund for Scientific Research of Fujian Medical University (Nos.2017XQ1071, 2018QH2035)]

林珉婷，本科，助理研究員，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病。E-mail: mintinglin@fjmu.edu.cn

姚香平，博士，主治醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病分子機(jī)制。E-mail: 119373522@qq.com

10.16288/j.yczz.20-138

2020/10/13 16:04:24

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201012.1713.002.html

(責(zé)任編委: 谷峰)