張悅，馮穎，馬芳,3

早期停育胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)基因與特征分析

張悅1，馮穎2，馬芳1,3

1. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院教育部“婦兒疾病與出生缺陷”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041 2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610041 3. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610041

滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)維持正常胚胎植入、生長發(fā)育有重要作用。研究停育胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞的基因表達(dá)差異有助于了解胚胎發(fā)育停止或不良妊娠結(jié)局的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。本研究通過對(duì)26例正常妊娠、胚胎停育婦女的絨毛組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序和初步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)胚胎停育組存在436個(gè)差異基因，其中406個(gè)mRNA為顯著上調(diào)基因，32個(gè)mRNA為顯著下調(diào)基因?；蚋患治鲲@示這些基因顯著富集于免疫相關(guān)功能、細(xì)胞間黏附等方面，如淋巴細(xì)胞激活、髓系細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)及膠原連接等，其潛在調(diào)控通路富集到補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解等條目。此外，本研究利用WGCNA共表達(dá)分析得到和差異基因存在共表達(dá)關(guān)系的lncRNA。根據(jù)模塊功能不同，繪制了兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖，可得4個(gè)關(guān)鍵基因，分別為和。本研究得到的這些差異基因可作為對(duì)胚胎停育具有潛在影響的關(guān)鍵分子，所富集到的條目可為深入了解胚胎發(fā)育停止或不良妊娠結(jié)局的病因及機(jī)制提供理論依據(jù)及方向。

滋養(yǎng)層細(xì)胞；RNA測序；富集分析；基因特征

早期絨毛組織的細(xì)胞構(gòu)成主要指滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophoblast)[1]。根據(jù)細(xì)胞功能及形態(tài)的特點(diǎn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞可分為細(xì)胞滋養(yǎng)層、合體滋養(yǎng)層和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞。其中，細(xì)胞滋養(yǎng)層分化為合體滋養(yǎng)層參與營養(yǎng)、分泌、代謝等功能[2]，而絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞主要參與遷移、侵襲作用入侵子宮內(nèi)膜及血管，建立母胎循環(huán)及啟動(dòng)血管重塑[3]。絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞作為直接和母體子宮內(nèi)膜接觸的細(xì)胞，目前認(rèn)為對(duì)維持胚胎正常發(fā)育有3大功能：侵襲遷移功能、內(nèi)分泌功能(包括自分泌及旁分泌)及免疫調(diào)節(jié)功能。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞通過分泌黏附因子(整合素、鈣黏素、選擇素及免疫球蛋白超家族[4])對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別及黏附，并通過分泌水解酶(基質(zhì)金屬蛋白酶、纖維蛋白酶等)降解植入部位的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行遷移、浸潤，以完成正常的胚胎植入。其中，整合素家族和子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)，整合素αvβ3表達(dá)不足會(huì)降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致胚胎著床能力低下，引起流產(chǎn)或胚胎發(fā)育遲滯[5]。而過高的水解酶會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞過度浸潤，引起妊娠期高血壓、侵入性胎盤疾病等病理妊娠[6]。滋養(yǎng)層細(xì)胞還通過分泌細(xì)胞因子(如表皮生長因子EGF[7]、轉(zhuǎn)化生長因子TGF[8]及集落刺激因子CSF-1[9]等)調(diào)節(jié)自身增殖分化、能量代謝及侵襲功能等。其中，EGF表達(dá)異常可能造成滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲不足、胎盤血管重鑄障礙，最終引起流產(chǎn)[7]。TGF的表達(dá)不足影響滋養(yǎng)層細(xì)胞分化，造成胎盤發(fā)育不良[8]。此外，滋養(yǎng)層細(xì)胞可分泌激素(人絨毛膜促性腺激素hCG、孕酮等)維持早期胚胎發(fā)育及妊娠。hCG能維持及促進(jìn)母體卵巢分泌雌、孕激素，并作為早孕時(shí)判斷胚胎發(fā)育停止的指標(biāo)之一。因此，絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚胎植入、發(fā)育及胎盤生長、妊娠結(jié)局等均有重要影響，而絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的異常形態(tài)及功能障礙往往提示胚胎停育或不良妊娠結(jié)局。據(jù)報(bào)道[9]，普通光學(xué)顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)停育胚胎的絨毛組織形態(tài)異常，出現(xiàn)絨毛間質(zhì)水腫，合體滋養(yǎng)層核固縮等病理改變。經(jīng)凋亡小體檢測發(fā)現(xiàn)，停育胚胎的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多[10]?？紤]到目前胚胎停育的病因復(fù)雜，且部分患者未能找到病因，深入研究異常滋養(yǎng)層細(xì)胞變化能在一定程度上對(duì)胚胎停育及不良妊娠結(jié)局做出解釋。本研究借助全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對(duì)停育胚胎的絨毛組織進(jìn)行大規(guī)模的基因篩選及挖掘，尋找異常變化的基因，預(yù)測其變化對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)功能的潛在影響，為臨床上不明原因性胚胎停育的病因及分子生物學(xué)機(jī)制做出一定解釋。

1 材料與方法

1.1 樣本收集及制備

26例患者的絨毛組織均來自華西第二醫(yī)院門診手術(shù)室，其中10例用于轉(zhuǎn)錄組測序，其中5例為無生育要求進(jìn)行人工流產(chǎn)的患者(對(duì)照組)，5例患者為經(jīng)B超檢測確診胚胎停育進(jìn)行清宮術(shù)的患者(胚胎停育組)。剩余16例用于驗(yàn)證測序結(jié)果，其中9例為無生育要求進(jìn)行人工流產(chǎn)的患者(對(duì)照組)，7例患者為經(jīng)B超檢測確診胚胎停育進(jìn)行清宮術(shù)的患者(胚胎停育組)。兩組別中對(duì)照組患者平均年齡29.2歲，孕周46.4 d，胚胎停育組患者平均年齡30.6歲，孕周60.2 d，患者臨床信息(參與轉(zhuǎn)錄組測序的臨床樣本)見表1。患者術(shù)后的絨毛組織立即置于4℃冰盒中防止RNA降解。加入10%中性福爾馬林固定12 h，依次通過50%酒精、70%酒精梯度脫水，進(jìn)行石蠟包埋。所有的總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、文庫構(gòu)建由南京極光基因科技有限公司完成。本研究通過了四川大學(xué)華西第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查，參與研究的所有患者均簽署了知情同意書。

1.1 樣本收集及測序

以Trizol法提取總RNA，每個(gè)樣本取3 μg的總RNA作為起始量構(gòu)建文庫，使用試劑盒Ribo-ZeroTMGoldKits (北京New England Biolabs公司)去除樣品中的rRNA，并在兩端添加測序引物結(jié)合位點(diǎn)，在Illumina HiSeq2000平臺(tái)上進(jìn)行測序。測序結(jié)束后，通過去除低質(zhì)量序列，去接頭污染，去除rRNA后得到高質(zhì)量序列(clean reads)，后續(xù)分析基于高質(zhì)量序列。采取HiSAT2將過濾后的RNA-seq數(shù)據(jù)同人基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)。

1.2 差異mRNA的篩選

采用FPKM (fragments per kilobase per millon mapped fragments)定量估計(jì)基因的總表達(dá)量，采用R包ggplot2對(duì)總基因數(shù)繪制箱式圖進(jìn)行比較。采用DEseq進(jìn)行差異表達(dá)分析，定義值≤0.05或者|log2ratio|≥1的基因?yàn)椴町恗RNA。采用R包ggplot2對(duì)差異mRNA繪制火山圖，采用R包pheatmap對(duì)差異mRNA繪制熱圖。

1.3 差異mRNA的注釋及富集分析

采用omicshare在線平臺(tái)(https://www.omicshare. com/tools/home/soft/getsoft.html)對(duì)篩選出的基因進(jìn)行了GO基因功能(gene ontology, GO)和KEGG通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)的富集分析，以FDR<0.05作為顯著性的閾值。

1.4 加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析WGCNA篩選核心lncRNA

使用R包WGCNA構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行模塊劃分[11]。首先準(zhǔn)備基因矩陣，將差異mRNA按差異倍數(shù)(fold change, FC)排序，選擇前20個(gè)差異mRNA及所有l(wèi)ncRNA納入分析。同時(shí)，剔除了平均表達(dá)量低于0.5的低質(zhì)量RNA，并利用函數(shù)hclust進(jìn)行聚類，剔除了離群樣本。采用pick soft threshold計(jì)算權(quán)重值，采用power=9，使用blockwiseModules構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)[12]，對(duì)基因進(jìn)行模塊分析。每個(gè)模塊的最低基因容量為50，利用函數(shù)plot dendro and colors繪制樹狀圖并對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行顏色可視化。最后，確定了差異mRNA所在的兩個(gè)模塊作為目標(biāo)模塊，進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 患者臨床信息(參與轉(zhuǎn)錄組測序的臨床樣本)

?：因患者未進(jìn)行此項(xiàng)檢查，數(shù)據(jù)缺失。

1.5 差異mRNA及l(fā)ncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

選擇WGCNA中富集到的兩個(gè)模塊，根據(jù)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度(weight)和關(guān)聯(lián)數(shù)(edge)篩選最有可能和差異mRNA互作的lncRNA。lncRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)為weight值>0.6且和差異mRNA至少存在一條直接連接。使用cytoscape軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 差異表達(dá)mRNAs和lncRNAs實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，選取了10個(gè)mRNAs (包括后續(xù)分析所得模塊中的核心mRNA，和)和4個(gè)lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證。納排標(biāo)準(zhǔn)與前期測序的樣本一致，能有效保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。根據(jù)Ensemble (http:// asia.ensembl.org/index.html)提供的序列，使用在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站Primer3Plus (http://www.primer3plus.com/ cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)設(shè)計(jì)引物，并通過BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM= blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。以Trizol法提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (美國Thermo Fisher公司)，引物序列見表2。以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2–ΔΔCt法計(jì)算兩組中差異表達(dá)mRNAs和lncRNAs的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R語言(3.6.1)進(jìn)行算法分析及可視化圖形?；颊叩呐R床信息采用描述性統(tǒng)計(jì)，兩組別間所有mRNA采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)分析采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常與胚胎停育組絨毛組織存在436個(gè)差異mRNA、41個(gè)差異lncRNA

經(jīng)高通量測序、數(shù)據(jù)過濾后，10例絨毛樣本的基因總體表達(dá)值(圖1A)，log2(FPKM+1)值集中于2~3，說明各樣本間基因數(shù)均一，測序質(zhì)量良好，具有良好的可比性。經(jīng)過差異表達(dá)分析后，發(fā)現(xiàn)有436個(gè)mRNA在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胚胎停育組相較于正常對(duì)照有406個(gè)mRNA顯著上調(diào)，32個(gè)mRNA顯著下調(diào)(圖1B)。此外，發(fā)現(xiàn)41個(gè)lncRNA在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胚胎停育組相較于正常對(duì)照有28個(gè)lncRNA顯著上調(diào)，13個(gè)lncRNA顯著下調(diào)(圖1C)。對(duì)差異mRNA及l(fā)ncRNA進(jìn)行表達(dá)聚類分析，從藍(lán)到黃表示表達(dá)水平從低到高，發(fā)現(xiàn)各組均可形成獨(dú)立的簇，說明兩組別間生物學(xué)重復(fù)較好。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列表

圖1 差異基因的表達(dá)情況

A：10例樣本的基因總體表達(dá)量(箱式圖)；B：兩組別的差異mRNA分析(熱圖)；C：兩組別的差異lncRNA分析(熱圖)。

2.2 代表性差異mRNA及l(fā)ncRNA的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致

為了確定測序結(jié)果的正確性，分別選擇了10個(gè)mRNA (包括后續(xù)分析所得模塊中的核心mRNA,和)和4個(gè)lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (圖2)。圖2A、B結(jié)果是通過轉(zhuǎn)錄組測序所得的差異mRNA和lncRNA相對(duì)表達(dá)量。在胚胎停育組中，基因的mRNA水平顯著高于對(duì)照組，基因的mRNA水平顯著低于對(duì)照組。對(duì)于lncRNA而言，CLRN1- AS1、AC104809.4、LINC01136、USP27X-AS1的水平顯著高于對(duì)照組。圖2 C、D結(jié)果是通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得的差異mRNA和lncRNA相對(duì)表達(dá)量。在胚胎停育組中，基因的mRNA水平顯著高于對(duì)照組，基因的mRNA水平顯著低于對(duì)照組。對(duì)于lncRNA而言，CLRN1- AS1、AC104809.4、LINC01136、USP27X-AS1的水平顯著高于對(duì)照組。此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符合。為了更為直觀地比較兩種方法所得結(jié)果的一致性，計(jì)算了兩組間的相對(duì)表達(dá)比值(胚胎停育組相對(duì)于對(duì)照組的差異倍數(shù)) (圖2，E和F)，在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中顯著上調(diào)/下調(diào)的mRNA和lncRNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中也呈現(xiàn)顯著上調(diào)/下調(diào)的趨勢。由此推斷，這些差異mRNA及l(fā)ncRNA在qRT-PCR中的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，說明本研究的測序結(jié)果具有一定的可信度。

2.3 差異mRNA功能富集于細(xì)胞外基質(zhì)黏附、免疫功能類別

為了深入分析差異mRNA的具體功能，選擇436個(gè)mRNA進(jìn)行GO分析，共富集到54個(gè)條目(FDR<0.05) (圖3A)。其中，分別富集到生物學(xué)過程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular compo-nent, CC)和分子功能(molecular function, MF)的基因數(shù)分別為26條、17條及11條。在BP條目下的富集程度最高前3個(gè)的條目為細(xì)胞內(nèi)過程(cellular process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)和生物學(xué)過程調(diào)節(jié)(regulation of biological 下的富集程度最高前3個(gè)的條目為細(xì)胞(cell)、細(xì)胞組分(cell part)和細(xì)胞器(organelle)。在MF條目下的富集程度最高前3個(gè)的條目為連接(binding)、催化過程(catalytic activity)和分子傳導(dǎo)過程(molecular transducer activity)。436個(gè)mRNA進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到36個(gè)條目(FDR<0.05) (圖3B)。其中，代謝相關(guān)通路富集程度最高的是脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)和碳水化合物代謝(carbohydrate metabo-lism)，其他二級(jí)信號(hào)通路富集程度最高前3個(gè)分別是免疫系統(tǒng)(immune system)、感染性疾病(infectious process)。在CC條目 diseases)和信號(hào)傳導(dǎo)(signal transduction)。為進(jìn)一步明確二級(jí)信號(hào)通路下屬的具體條目，按置信度從低到高將所有信號(hào)通路進(jìn)行排列，列出了前10條富集程度最高的信號(hào)通路(表3)。從表3可知，胚胎停育組中差異基因富集于補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)、吞噬體、血小板活及微生物感染相關(guān)的通路。已有的研究已經(jīng)表明，過度的補(bǔ)體系統(tǒng)激活[13]、凝血系統(tǒng)激活[14]、細(xì)胞外基質(zhì)降解[15]、血小板激活[16]均引起免疫系統(tǒng)過度攻擊胚胎并導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，而富集于微生物感染相關(guān)通路可能是由于免疫失衡后，機(jī)體對(duì)胚胎的攻擊和感染性疾病類似，且胚胎停育后植入部位易引起感染。

圖2 差異mRNA及l(fā)ncRNA的qRT-PCR、轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證結(jié)果

A：兩組別間差異mRNA相對(duì)表達(dá)量(轉(zhuǎn)錄組測序)；B：兩組別間差異lncRNA相對(duì)表達(dá)量(轉(zhuǎn)錄組測序)；C：兩組別間差異mRNA相對(duì)表達(dá)量(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)；D：兩組別的差異lncRNA相對(duì)表達(dá)量(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)；E：差異mRNA相對(duì)表達(dá)比值=胚胎停育組/對(duì)照組(取log2對(duì)數(shù)后)；F：差異lncRNA相對(duì)表達(dá)比值=胚胎停育組/對(duì)照組(取log2對(duì)數(shù)后)。

圖3 差異mRNA的GO功能和KEGG通路富集分析

A：兩組別差異mRNA的GO功能分析；B：兩組別差異mRNA的KEGG功能分析。

2.4 篩選細(xì)胞外基質(zhì)黏附、免疫功能模塊下具有共表達(dá)關(guān)系的6個(gè)核心lncRNA

為篩選和差異mRNA有共表達(dá)關(guān)系的lncRNA，采用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)WGCNA (weighted gene co- expression network analysis)分析差異mRNA及l(fā)ncRNA的相關(guān)性。WGCNA是基于待測基因間的共表達(dá)關(guān)系對(duì)基因進(jìn)行模塊分類．從而呈現(xiàn)基因的全局表達(dá)規(guī)律，并通過尋找與樣本性狀相關(guān)的模塊和候選基因，為下游機(jī)制方面的研究提供方向。

在本研究中，根據(jù)差異mRNA及l(fā)ncRNA的共表達(dá)關(guān)系，可聚類為4個(gè)聚類樹，樹的一個(gè)分支代表一簇表達(dá)量高度相關(guān)的基因模塊(圖4A)。通過動(dòng)態(tài)剪切樹法對(duì)各模塊進(jìn)行區(qū)分，并根據(jù)模塊相似度(0.8)合并相似模塊，最終得到4個(gè)模塊，分別為Blue模塊(1236個(gè))、Brown模塊(1227個(gè))、Green模塊(642個(gè))和Turquoise模塊(1292個(gè)) (圖4B)。在Brown和Turquoise這兩個(gè)模塊中，按照篩選標(biāo)準(zhǔn)：連接程度大于0.6且和差異mRNA至少存在一條直接連接，確定了兩個(gè)模塊中的lncRNA，并對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制(圖5)。圖5A是Brown模塊的網(wǎng)絡(luò)圖，包括58個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)和201條邊(edge)。藍(lán)色圓形符號(hào)包括差異基因和，紅色矩形符號(hào)代表與其相連的lncRNA，其中連接度最高的lncRNA是RP11-212I21.4LINC00954RP11- 327J17.9。圖5B是Turquoise模塊的網(wǎng)絡(luò)圖，包括55個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)和285條邊(edge)。藍(lán)色圓形符號(hào)包括差異基因和，紅色矩形符號(hào)代表與其相連的lncRNA，其中連接度最高的lncRNA是CTD-2201G3.1RP11-147L13.11RP11-541N10.3。

表3 差異mRNA的KEGG富集分析(置信度最高的前10條信號(hào)通路)

Brown模塊以和為核心基因，根據(jù)表3可知，和是KEGG富集分析中補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)(complement and coagulation ca-scades,3.70E-07)通路下的基因，故本研究推測和可能協(xié)同該模塊其他基因及共表達(dá)lncRNA介導(dǎo)補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。已有的研究表明[17,18]，生理狀態(tài)下的補(bǔ)體成分激活對(duì)妊娠及胎兒發(fā)育是有利的，但是過度激活可導(dǎo)致炎癥損傷，免疫紊亂。因此，滋養(yǎng)層細(xì)胞中過度升高的和可能協(xié)同該模塊其他基因過度激活了補(bǔ)體系統(tǒng)，可能導(dǎo)致植入部位免疫應(yīng)激狀態(tài)，最后引起母胎免疫耐受失衡。同時(shí)，凝血系統(tǒng)的激活容易引發(fā)凝血–抗凝機(jī)制或纖溶活性失衡，引起微血栓形成，使得絨毛或胎盤發(fā)育受限。

圖4 基因聚類系統(tǒng)樹狀圖及模塊劃分

A：基于拓?fù)渲丿B網(wǎng)絡(luò)的聚類樹；B：動(dòng)態(tài)剪切法得到的基因模塊。每一個(gè)顏色代表一類表達(dá)程度相似的基因，共4個(gè)模塊，分別為Blue模塊(1236個(gè)基因)、Brown模塊(1227個(gè)基因)、Green模塊(642個(gè)基因)和Turquoise模塊(1292個(gè)基因)。

圖5 候選mRNA及相關(guān)lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

A：Brown模塊所富集到的差異mRNA及共表達(dá)lncRNA；B：Turquoise模塊所富集到的差異mRNA及共表達(dá)lncRNA。節(jié)點(diǎn)橢圓形為mRNA，長方形為lncRNA。節(jié)點(diǎn)顏色越深表示關(guān)聯(lián)程度越高。

Turquoise模塊以和為核心基因，根據(jù)表3可知，和是KEGG富集分析中細(xì)胞外基質(zhì)(cell adhesion molecules,3.78E-07)通路下的基因，因此推測和可能協(xié)同該模塊其他基因及共表達(dá)lncRNA對(duì)胚胎停育時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和降解有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于維持植入部位的正常細(xì)胞間連接及細(xì)胞-基質(zhì)黏附非常重要，同時(shí)也是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的場所，過度的細(xì)胞外基質(zhì)降解不利于絨毛的早期發(fā)育和免疫耐受的建立，可能引起妊娠丟失。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚胎發(fā)育早期有重要作用，承擔(dān)內(nèi)分泌、遷移侵入及免疫調(diào)節(jié)等多種功能[19,20]，且和宮內(nèi)生長受限[21]、妊娠期高血壓、子癇[22]和早產(chǎn)[23]等妊娠疾病密切相關(guān)。在胚胎發(fā)育早期，滋養(yǎng)層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能異?？赡芤鹋咛ブ踩胧?、胚胎發(fā)育停止，可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[24,25]。但目前胚胎停育原因復(fù)雜，具體機(jī)制未明。通過研究滋養(yǎng)層細(xì)胞的異常變化可以幫助理解胚胎停育的發(fā)生機(jī)制，找到可能對(duì)胚胎停育存在潛在影響的關(guān)鍵分子。因此，本研究通過收集臨床胚胎停育患者的絨毛組織，尋找可能引起滋養(yǎng)層細(xì)胞功能改變的重要的基因，共篩選到436個(gè)差異基因，并通過GO、KEGG富集分析對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋及信號(hào)通路預(yù)測，發(fā)現(xiàn)停育胚胎的絨毛組織中存在過度的補(bǔ)體反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解不足的情況，可能引起母體對(duì)胎兒細(xì)胞的過度攻擊或胚胎發(fā)育障礙，從而導(dǎo)致胚胎停育。同時(shí)，為了尋找可能對(duì)mRNA存在調(diào)控的lncRNA，本研究利用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Green和Turquoise模塊富集到了較多的差異mRNA，并找到了和差異mRNA呈高共表達(dá)關(guān)系的lncRNA。

通過差異表達(dá)分析，本研究在對(duì)照組和胚胎停育組間共發(fā)現(xiàn)了436個(gè)差異基因，胚胎停育組相較于正常對(duì)照顯著上調(diào)的基因較多，406個(gè)mRNA顯著上調(diào)，32個(gè)mRNA顯著下調(diào)?；诖诉M(jìn)行文獻(xiàn)回顧后發(fā)現(xiàn)，Yang等[26]通過對(duì)絨毛組織全轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)早期胚胎丟失(early embryonic arrest, EEA)相較于對(duì)照組也存在大量mRNA上調(diào)的情況。Pan等[27]的研究顯示通過對(duì)妊娠丟失患者絨毛的蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)早期胚胎丟失相較于對(duì)照組存在大量蛋白上調(diào)的情況。由此可知，本研究結(jié)果和以往類似研究結(jié)果趨勢一致，說明本研究結(jié)果具有一定可信度。其中均被報(bào)道和胚胎停育、母胎界面免疫異?；蜃甜B(yǎng)層細(xì)胞功能障礙有關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)這些基因和以往研究相類似，說明本研究結(jié)果較為可信。通過對(duì)差異mRNA進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞組分條目下差異mRNA顯著富集于細(xì)胞外基質(zhì)、膠原連接等，富集到該條目的基因有等。在分子功能條目下，差異mRNA顯著富集于淋巴細(xì)胞激活、髓系細(xì)胞激活等，說明當(dāng)發(fā)生胚胎停育時(shí)，絨毛組織中存在過度免疫反應(yīng)，可能和母胎免疫耐受失衡、啟動(dòng)流產(chǎn)發(fā)生有關(guān)，富集到該條目的基因有等。

通過KEGG的信號(hào)通路分析，本研究發(fā)現(xiàn)差異mRNA顯著富集在免疫系統(tǒng)中的信號(hào)通路數(shù)目較多，包括補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血小板激活，F(xiàn)cγR介導(dǎo)的吞噬作用等(表3)，提示停育后的絨毛組織中存在母胎免疫耐受異常和過度免疫炎性反應(yīng)。本研究篩選高置信度的前20個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)基因可能和絨毛組織中的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，分別是。其中(log2FC=3.791,=0.016)和(log2FC=4.142,=0.011)在胚胎停育組中表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，且富集到補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)這一信號(hào)通路中。是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域遏制蛋白4，和B7家族共抑制分子具有一定的同源性，主要表達(dá)于肺、胎盤組織中。目前主要認(rèn)為可作為T細(xì)胞受體的負(fù)向調(diào)節(jié)靶點(diǎn)[29]，同時(shí)在清除補(bǔ)體調(diào)理的病原或其他顆粒如自體成分[30]中發(fā)揮作用。被報(bào)道和免疫抑制密切相關(guān)，在胚胎停育組織中異常升高提示可能介導(dǎo)母胎界面的免疫抑制紊亂。是C1Q的其中一個(gè)亞基，而C1Q是經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的重要組成部分，能夠通過激活補(bǔ)體下游成分,誘導(dǎo)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的殺傷作用并提高吞噬作用[31]。補(bǔ)體廣泛分布于體內(nèi)，在滋養(yǎng)層細(xì)胞表面有高水平的表達(dá)[32]。具有凝血酶的C5組分可直接激活補(bǔ)體系統(tǒng)，介導(dǎo)炎癥損傷，影響胚胎及胎盤發(fā)育障礙，最終導(dǎo)致妊娠失敗[33]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)體過度活化可引起小鼠胎盤病理改變、炎癥因子增加和血栓形成[34]。由此推測，絨毛細(xì)胞中差異基因和可能介導(dǎo)了過度的補(bǔ)體激活，引起免疫耐受失衡，從而導(dǎo)致胚胎損傷，引起發(fā)育停止[35]。

同時(shí)，(log2FC=3.026,=0.006)和(log2FC=3.357,=0.002)作為本研究中置信度相對(duì)較高的基因，在KEGG分析中被富集到細(xì)胞外基質(zhì)這一信號(hào)通路，提示可能滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)降解出現(xiàn)異常，可能存在組織蛋白酶、金屬蛋白酶分泌異常的情況[36]。是廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種血細(xì)胞表面的一類跨膜糖蛋白受體[37]，可作為脂類受體、血小板受體及膠原受體調(diào)控多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)[38]、炎癥[39]、癌癥[40]的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等。又稱骨橋蛋白，主要參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞間基質(zhì)附著或免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程，是母胎界面粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的重要分子[41]。正常的胚胎著床和黏附需要多種基質(zhì)酶促使植入部位的子宮內(nèi)膜疏松而富有粘性[42]。當(dāng)胎兒的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌能力下降時(shí)，植入部位的細(xì)胞外基質(zhì)可能因過于致密導(dǎo)致植入失敗或胚胎發(fā)育障礙，從而導(dǎo)致胚胎停育或流產(chǎn)的發(fā)生[43]。在研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)時(shí)，可作為評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)，其水平的異常提示植入失敗或胚胎發(fā)育障礙。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)差異mRNA集中于炎性反應(yīng)和感染性疾病中，富集到了金黃色葡萄球菌感染、阿米巴病和肺結(jié)核等的信號(hào)通路中，推測原因可能是胚胎發(fā)育異常、停育后母胎免疫逐漸失衡，母體免疫系統(tǒng)開始將絨毛組織作為外來物進(jìn)行強(qiáng)烈的免疫排斥，并啟動(dòng)免疫反應(yīng)開始攻擊胎兒，此時(shí)的絨毛組織中也存在大量炎性反應(yīng)及免疫因子，這種胚胎停育后的攻擊狀態(tài)和感染性疾病類似。

同時(shí)，本研究通過WGCNA算法構(gòu)建了共表達(dá)模塊，尋找了和差異mRNA具有相關(guān)性的lncRNA。在Brown模塊的網(wǎng)絡(luò)圖中，連接度最高的是RP11- 212I21.4、LINC00954和RP11-327J17.9；在Turquoise模塊的網(wǎng)絡(luò)圖，連接度最高的是CTD-2201G3.1、RP11-147L13.11和RP11-541N10.3。這6個(gè)lncRNA和核心基因具有相類似的表達(dá)模式，其機(jī)制可能是由于差異mRNA及l(fā)ncRNA共同參與了某條通路或者受到同樣的調(diào)控，有可能協(xié)同發(fā)揮同一生物學(xué)功能。目前，由于大部分lncRNA的功能未明確，通過WGCNA共表達(dá)分析探究和差異mRNA具有相關(guān)性的lncRNA能從一定程度上預(yù)測其功能，同時(shí)從lncRNA的角度對(duì)兩組間出現(xiàn)的差異mRNA做出解釋，例如lncRNA通過選擇性剪切模式改變mRNA的亞型種類及表達(dá)水平或合成內(nèi)源性siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄干擾，從而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄水平[44,45]。

本研究也存在些許不足。首先，本次研究樣本量有限，僅納入14例人工流產(chǎn)患者作為對(duì)照和12例胚胎停育患者。因此本研究的結(jié)果還需要進(jìn)一步的大樣本測序結(jié)果來驗(yàn)證。本研究對(duì)于篩選到的lncRNA的功能未進(jìn)一步研究，希望在今后能開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以深入分析lncRNA對(duì)差異基因的確切的調(diào)控機(jī)制。其次，本研究使用的轉(zhuǎn)錄組測序流程依次為：首先去除rRNA，進(jìn)行文庫構(gòu)建(mRNA片段化、逆轉(zhuǎn)錄、雙鏈合成、末端補(bǔ)齊、末尾加A、加測序接頭、PCR富集)和Illumina測序，最后采用FPKM對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行相對(duì)定量分析[46,47]。但由于文庫PCR擴(kuò)增偏好性，可能存在所有序列不會(huì)被同比例放大的情況，可能對(duì)結(jié)果帶來一定程度的偏倚。

綜上所述，本研究通過全轉(zhuǎn)錄測序及初步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)可能對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能存在潛在影響的重要差異基因及相關(guān)lncRNA網(wǎng)絡(luò)。深入研究這些基因能從母胎免疫失衡和滋養(yǎng)層細(xì)胞植入不足等原因?qū)ε咛ネＳ鲆欢ń忉?，并為不明原因流產(chǎn)提供新的思路和方向。

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Related genes and characteristic analysis of trophoblast cells during early embryo developmental cessation

Yue Zhang1, Ying Feng2, Fang Ma1,3

Trophoblast cells play essential roles in the maintenance of normal embryo implantation, growth and development. The study of abnormal gene changes in trophoblastic cells from arrested embryos is helpful to understand the developmental mechanism of embryo developmental cessation or adverse pregnancy outcomes. In this study, we sequenced and analyzed the transcriptomes of the villi from ten women who have undergone abortion with either normal pregnancy or embryo development cessation. We found that there were 436 differentially expressed genes, of which 406 mRNA were significantly up-regulated and 32 mRNA were significantly down-regulated. Gene enrichment analysis showed that these genes were significantly enriched in immune-related functions and intercellular adhesion, such as lymphocyte activation, myeloid cell activation, extracellular matrix and collagen junction. And their potential regulatory pathways were enriched in terms of complement and coagulation cascade, extracellular matrix degradation. In addition, in this study the co-expression analysis of WGCNA was used to obtain the lncRNA with co-expression relationship with the differential genes. According to the different functions of the modules, two network diagrams were drawn, and four key genes were obtained, namelyand. These differential genes obtained in this study can be used as key molecules with potential effects on embryo development cessation. The enriched entries can provide a theoretical basis and new direction for further understanding of the etiology and mechanism of embryo development cessation or adverse pregnancy outcomes.

trophoblast; RNA-seq; enrichment analysis; genetic traits

2020-08-08;

2020-10-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31771662)和國家科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2018YFC1002803-3)資助[Supported by the National Nature Science Foundation of China (No. 31771662), and the National Science and Technology Major Project (No. 2018YFC1002803-3)]

張悅，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：母嬰醫(yī)學(xué)。E-mail: zhangyue@stu.scu.edu.cn

馬芳，教授，研究方向：糖生物學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)。E-mail: mafangmed@126.com

10.16288/j.yczz.20-144

2020/10/20 15:15:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201019.1300.003.html

(責(zé)任編委: 杜茁)