諶陽，王文君，付明，徐國強，周翔，劉榜

基于核質(zhì)遺傳原理建立多重PCR檢測方法鑒定阿膠中馬、驢源性成分及皮張種源

諶陽，王文君，付明，徐國強，周翔，劉榜

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070

阿膠()及其原料皮張源性成分的鑒定是對阿膠真實性的一種保障，阿膠生產(chǎn)企業(yè)和市場監(jiān)管部門急需馬、驢、騾皮張以及阿膠中源性成分鑒別的有效檢測方法。本研究基于馬、驢核基因組和線粒體基因組篩選物種特異性DNA序列作為檢測靶標(biāo)，設(shè)計馬、驢特異性引物，建立了鑒別馬、驢、騾皮張以及鑒定阿膠中馬和驢源性成分的多重PCR方法。結(jié)果顯示，本文所建立的方法可用于阿膠源性成分及皮張種源的鑒別，其特異性強，只在目標(biāo)物種中擴增出目的條帶，而非目標(biāo)物種中沒有任何擴增產(chǎn)物，而且靈敏度能達(dá)到0.2 ng，可為阿膠生產(chǎn)企業(yè)和市場監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。

阿膠；核基因；線粒體基因；多重PCR；馬、驢源性成分

阿膠()是利用馬科動物驢(L.)的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮而成，自宋代阿膠之名為驢皮獨享，記載于宋以后沿用至今。阿膠是亞洲人常用的保健品，需求量逐年增加，但驢皮的數(shù)量遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需要。據(jù)報道2013年阿膠市場用量約為3500噸，約需驢皮280萬張左右，而我國當(dāng)年驢的出欄量僅237.8萬頭，無法滿足阿膠生產(chǎn)的需求[1]。這種驢皮供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，使得驢皮的價格上漲了30多倍[2]。一些不法分子在利益驅(qū)使下，用與驢皮相似的馬皮和騾皮冒充驢皮銷售，以致阿膠中摻入馬和騾的成分[3,4]，使阿膠功效發(fā)生改變，擾亂市場秩序，損害了商家信譽及消費者權(quán)益。在市場監(jiān)管中，急需針對阿膠中馬和驢源性成分鑒定及其原料馬、驢、騾皮張鑒別的檢測方法。

21世紀(jì)初期，由于核酸的特異性和穩(wěn)定性，以核酸為靶標(biāo)的PCR方法逐漸開始被應(yīng)用到皮張和阿膠的鑒定中，但多以線粒體DNA為靶標(biāo)，如基于線粒體細(xì)胞色素基因()建立PCR-RFLP方法、半巢式–多重PCR方法進(jìn)行皮張鑒別和阿膠中源性成分的檢測[5~7]；基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I ()的PCR和實時熒光PCR鑒定阿膠中的源性成分[8,9]。目前針對阿膠和皮張鑒別的靶標(biāo)主要是線粒體DNA，但由于線粒體DNA母系遺傳的特點，使其在馬、驢和騾種源鑒定方面具有局限性，無法鑒別驢和驢騾、馬和馬騾。僅有一篇結(jié)合線粒體DNA和核基因組靶標(biāo)，建立實時熒光PCR方法并成功鑒別馬、驢、馬騾和驢騾皮張的報道[10]，但其不涉及阿膠成品的檢測。因此，對于阿膠和皮張種源成分的鑒別需要開發(fā)新的檢測方法。

基于遺傳學(xué)中核質(zhì)遺傳基本原理：騾的核遺傳物質(zhì)一半來自于馬，另一半來自于驢；而細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)——線粒體DNA全部來自于母本，馬騾和驢騾的線粒體DNA分別來自于馬和驢。據(jù)此，本研究利用馬、驢、馬騾和驢騾在核基因組和線粒體DNA上的差異來篩選特異性靶標(biāo)，建立馬、驢核基因和線粒體基因的多重PCR檢測方法，進(jìn)行馬、驢、馬騾、驢騾皮張和阿膠中馬、驢源性成分的鑒別。

1 材料方法

1.1 樣品采集與制備

皮張樣品：市場采集馬皮(6張)、驢皮(6張)和騾皮(馬騾皮2張、驢騾皮1張)。

阿膠樣品：市場購買驢皮阿膠1份；委托阿膠生產(chǎn)企業(yè)按其工藝流程制作了2種騾皮和驢皮混合阿膠、3種未標(biāo)明原料皮張成分的阿膠樣品(含馬和驢源性成分)。

1.2 DNA提取

皮張樣品DNA提?。厚R皮、驢皮、馬騾皮和驢騾皮按照苯–酚氯仿抽提法提取DNA[11]。

阿膠樣品DNA提?。喝?00 mg阿膠樣品置于2 mL EP管中，加入1 mL裂解液；阿膠溶解后，加入15 μL 蛋白酶K，56℃消化2 h；在消化好的樣品中加入等體積的Tris飽和酚，緩慢顛倒10 min，然后4℃、12,000 r/min離心10 min；移上清液于2 mL EP管中，加入等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻10 min，4℃、12,000 r/min離心10 min；移上清液于2 mL EP管中，加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻10 min，4℃、12,000 r/min離心10 min；移上清液于新的2 mL EP管中，然后利用OMEGA DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。

陰性對照DNA樣品：大鼠()、小鼠()、倉鼠()、豚鼠()、普通牛()、水牛()、綿羊()、山羊()、豬()、兔()、狐()、狗()和貉()等物種DNA來自實驗室前期儲備。

1.3 馬、驢物種特異核基因與線粒體基因檢測靶標(biāo)篩選與引物設(shè)計

首先，在NCBI數(shù)據(jù)庫下載馬、驢核基因組和線粒體DNA序列，通過本地BLAST將馬、驢基因組序列與其他哺乳動物(普通牛、水牛、綿羊、山羊、豬)全基因組序列進(jìn)行比對，最終篩選出馬核基因和驢核基因以及馬、驢線粒體基因序列；然后應(yīng)用Bioedit對篩選出的馬、驢的DNA序列進(jìn)行同源性多重比對，并利用NCBI-Primer網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計(www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast)，確保引物的物種內(nèi)保守性和物種間特異性，并使所設(shè)計的引物具有相同的退火溫度。引物信息見表1。

1.4 馬、驢物種特異性PCR擴增體系建立

1.4.1 馬、驢物種特異性PCR擴增

馬、驢核基因和線粒體基因的PCR檢測體系均以目標(biāo)物種馬、驢、馬騾、驢騾的DNA為檢測樣品模板，以非目標(biāo)物種大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、普通牛、水牛、綿羊、山羊、豬、兔、狐、狗、貉的基因組DNA為陰性對照模板。PCR擴增體系：上下游引物各0.2 μmol/L，0.025 U/μL，0.2 mmol/L dNTP，1× buffer(TaKaRa公司)，模板50 ng，用無菌超純H2O補足到20 μL。擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，擴增35個循環(huán)；72℃終延伸30 s，4℃保存。

1.4.2 馬、驢特異性PCR擴增體系靈敏度檢測

提取馬皮和驢皮基因組DNA，用Nanodrop定量到10 ng/μL，然后10倍梯度稀釋(101、100、10–1、10–2、10–3)。取馬的稀釋模板2 μL用于馬核基因和線粒體基因特異性PCR擴增靈敏度檢測，同樣取2 μL驢的稀釋模板檢測驢的核基因和線粒體基因特異性PCR擴增靈敏度，即每個濃度梯度對應(yīng)的DNA量為20 ng、2 ng、0.2 ng、0.02 ng和0.002 ng，按照模板中的DNA量計算靈敏度。除DNA模板外其他試劑用量和擴增程序同1.4.1。

1.4.3 馬、驢特異性PCR擴增體系保守性檢測

分別以不同個體馬皮、驢皮DNA樣品為模板檢測核基因和線粒體基因特異性PCR擴增的保守性，擴增體系和程序同1.4.1。

1.5 馬、驢、騾皮張和阿膠加工品的檢測

馬、驢核基因二重PCR擴增體系包括Horse-NF、Horse-NR、Donkey-NF和Donkey-NR引物各0.2 μmol/L，0.025 U/μL，0.2 mmol/L dNTP，1×buffer，模板50 ng，H2O補足到20 μL。擴增程序與PCR特異性檢測相同(見1.4.1)。

馬、驢線粒體基因二重PCR擴增體系包括Horse-MF、Horse-MR、Donkey-MF和Donkey-MR引物各0.2 μmol/L，、dNTP、1×buffer等試劑用量和擴增程序同1.4.1。

馬、驢、騾皮張檢測，先利用馬、驢核基因二重PCR檢測體系對馬、驢和騾皮進(jìn)行鑒別，對鑒別出的騾再采用馬、驢線粒體基因二重PCR檢測體系區(qū)別馬騾和驢騾。

表1 擴增馬、驢目的基因引物信息

引物名稱中的N表示核DNA，M表示線粒體DNA。

阿膠樣品的檢測，利用上述馬、驢核基因二重PCR鑒別阿膠中的源性成分，其中檢測的阿膠樣品DNA為100 ng，擴增體系與馬、驢核基因二重PCR相同，擴增程序同1.4.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬、驢物種特異性PCR擴增體系建立

本研究建立的馬和驢核基因、馬和驢線粒體基因共4個特異性PCR擴增體系均能特異性地分別在馬、驢、馬騾、驢騾目標(biāo)物種中進(jìn)行擴增，馬、驢核基因特異性PCR擴增片段分別為166 bp和144 bp，馬、驢線粒體基因特異性PCR擴增片段分別是179 bp和130 bp?？瞻缀完幮詫φ罩袩o任何擴增產(chǎn)物，說明4個PCR擴增體系都具有特異性(圖1)。

將馬和驢的DNA分別稀釋為10 ng/μL、1 ng/μL、10–1ng/μL、10–2ng/μL、10–3ng/μL共5個濃度梯度，進(jìn)行馬和驢4對引物特異性PCR的靈敏度檢測。馬、驢核基因特異性PCR擴增體系能擴增出目的條帶的最低模板濃度分別為0.1 ng/μL和0.01 ng/μL；馬、驢線粒體基因特異性PCR擴增體系能擴增出目的條帶的最低模板濃度均為0.01 ng/μL (圖2)。由此可知，馬和驢核基因PCR檢測靈敏度分別是0.2 ng和0.02 ng，線粒體基因PCR檢測靈敏度均為0.02 ng。

采用馬和驢各6個個體的DNA樣品進(jìn)行馬和驢特異性擴增體系的種內(nèi)保守性檢測，馬和驢核基因特異性PCR分別擴增出166 bp和144 bp的目的條帶，馬和驢線粒體基因特異性PCR分別擴增出179 bp和130 bp的目的條帶，而且4個特異性PCR擴增體系在各自6個樣品中擴增片段大小一致(圖3)。以上結(jié)果表明馬和驢特異性擴增體系在物種內(nèi)具有保守性。

2.2 馬、驢源性成分二重PCR擴增體系

上述結(jié)果表明本研究所建立的馬和驢的 4個特異性PCR擴增體系均可以進(jìn)行種源成分鑒定。為了實現(xiàn)在一個擴增體系中快速、簡便地進(jìn)行馬、驢、騾種源成分的鑒別，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立馬、驢核基因和線粒體基因二重PCR檢測體系。兩組二重PCR檢測體系能夠特異性在馬、驢、馬騾、驢騾目標(biāo)物種中進(jìn)行擴增，而空白和陰性對照中無任何擴增產(chǎn)物(圖4)。其中利用馬、驢核基因二重PCR進(jìn)行檢測時，在馬和驢中僅有1條擴增條帶，分別為166 bp和144 bp；在馬騾和驢騾中都有166 bp和144 bp兩條擴增條帶(圖4A)，從擴增結(jié)果可以區(qū)分出馬、驢和騾，但不能區(qū)分馬騾和驢騾。再利用馬、驢線粒體基因二重PCR進(jìn)行檢測，在馬騾中有和馬相同的179 bp擴增條帶；在驢騾中有和驢相同的130 bp擴增條帶(圖4B)。綜上所述，可以通過核基因二重PCR鑒別出馬、驢和騾；再利用線粒體基因二重PCR進(jìn)一步將騾中的馬騾和驢騾進(jìn)行區(qū)分。

圖1 馬、驢物種特異性PCR擴增結(jié)果

A：馬核基因特異性PCR擴增結(jié)果；B：驢核基因特異性PCR擴增結(jié)果；C：馬線粒體基因特異性PCR擴增結(jié)果；D：驢線粒體基因特異性PCR擴增結(jié)果。M：DNA Marker；1：空白對照；2：馬；3：驢；4：馬騾；5：驢騾；6~18：陰性對照(分別是普通牛、水牛、綿羊、山羊、豬、兔、狐、狗、貉、大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠)。

圖2 馬和驢特異性PCR擴增體系靈敏度檢測

A：馬核基因特異性擴增體系靈敏度檢測；B：驢核基因特異性擴增體系靈敏度檢測；C：馬線粒體基因特異性擴增體系靈敏度檢測；D：驢線粒體基因特異性擴增體系靈敏度檢測。M：DNA Marker；Control：空白對照。

圖3 馬和驢特異性擴增體系種內(nèi)保守性檢測結(jié)果

A：馬核基因特異性擴增體系保守性檢測；B：驢核基因特異性擴增體系保守性檢測；C：馬線粒體基因特異性擴增體系保守性檢測；D：驢線粒體基因特異性擴增體系保守性檢測。M：DNA Marker；Control：空白對照；N：陰性對照；1~6：DNA檢測樣本。

2.3 馬、驢和騾皮張鑒別

利用馬、驢核基因二重PCR檢測方法對馬、驢、騾皮進(jìn)行鑒別，馬皮樣品的擴增產(chǎn)物均是1條166 bp條帶，驢皮樣品的擴增產(chǎn)物均為1條144 bp條帶，騾皮樣品則均有166 bp和144 bp兩條擴增條帶(圖5A)，從而可區(qū)別馬、驢、騾皮。

隨后采用馬、驢線粒體基因二重PCR檢測方法區(qū)別上述鑒別出的騾皮，馬騾皮擴增產(chǎn)物是1條179 bp的條帶，與馬皮的擴增產(chǎn)物一致；驢騾皮擴增產(chǎn)物是1條130 bp的條帶，與驢皮的擴增產(chǎn)物一致(圖5B)，基于此成功鑒別出馬騾皮和驢騾皮。綜上所述，結(jié)合馬、驢核基因和馬、驢線粒體基因二重PCR檢測方法能準(zhǔn)確鑒別馬、驢、馬騾和驢騾皮張。

2.4 阿膠中馬、驢源性成分鑒定

利用馬、驢核基因二重PCR檢測方法對阿膠樣品進(jìn)行檢測，驢皮阿膠樣品僅擴增出1條144 bp條帶，僅含有驢源性成分；而2種騾皮和驢皮混合的阿膠樣品和3種未標(biāo)明原料皮張成分的阿膠樣品都擴增出166 bp和144 bp兩條帶，則既含有馬源性成分又含有驢源性成分(圖6)，說明委托加工的5種阿膠樣品中均含有馬源性成分。檢測結(jié)果與實際情況相符。由此可見在進(jìn)行阿膠中種源成分檢測時，只要在驢皮中摻入馬和騾，利用馬、驢核基因二重PCR檢測方法都能檢測出阿膠中的馬和驢源性成分。

圖4 馬、驢二重PCR擴增體系特異性檢測結(jié)果

A：馬、驢核基因二重PCR特異性檢測結(jié)果；B：馬、驢線粒體基因二重PCR特異性檢測結(jié)果。M：DNA Marker；1：空白對照；2：馬；3：驢；4：馬騾；5：驢騾；6~18：陰性對照(分別是普通牛、水牛、綿羊、山羊、豬、兔、狐、狗、貉、大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠)。

圖5 馬皮、驢皮、馬騾皮和驢騾皮鑒別結(jié)果

A：馬皮、驢皮和騾皮鑒別結(jié)果。M：DNA Marker；Control：空白對照；1~3：馬皮；4~6：驢皮；7~9：騾皮。B：馬騾皮和驢騾皮鑒別結(jié)果。M：DNA Marker；Control：空白對照；1：馬陽性對照；2：驢陽性對照；3、4：馬騾皮；5：驢騾皮。

圖6 阿膠中馬、驢源性成分鑒定結(jié)果

M：DNA Marker；Control：空白對照；1：馬陽性對照；2：驢陽性對照；3：驢皮阿膠樣品；4、5：委托加工騾皮和驢皮混合的阿膠樣品；6~8：委托加工未標(biāo)明原料皮張成分的阿膠樣品。

3 討論

多種動物源性成分混合使得實際樣品的檢測更為復(fù)雜，在1個 PCR 試管中檢測不同 DNA 靶標(biāo)往往會由于引物對之間會形成相互干擾和競爭而導(dǎo)致擴增效率降低[12]，因此DNA靶標(biāo)的選擇至關(guān)重要。所篩選的DNA靶標(biāo)在目標(biāo)物種中應(yīng)具有高度特異性，物種間有足夠多的變異區(qū)域，特別是親緣關(guān)系較近的物種應(yīng)能進(jìn)行區(qū)分；靶標(biāo)序列在同一物種內(nèi)部要高度保守，特別是引物序列區(qū)域不能有變異，如有變異將會使同一物種擴增結(jié)果不同而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。為此，本研究篩選出馬核基因、驢核基因、馬和驢線粒體基因作為靶標(biāo)，但由于4條序列在馬和驢中同源性較高，因此將引物設(shè)計在馬和驢靶標(biāo)基因序列有變異的區(qū)域，至少要求所設(shè)計的引物3'端有2個及以上堿基差異，從而有效保證所建立的PCR檢測體系在馬和驢中的擴增結(jié)果不同，確保其檢測方法的特異性。另外普氏野馬()是現(xiàn)在僅存的野馬，所篩選的馬特異性靶標(biāo)在普氏野馬和家馬中同源性較高，進(jìn)而保證了特異性PCR檢測體系的保守性，既能檢測出家馬也能檢測出普氏野馬。

在進(jìn)行皮張檢測時，利用本研究所建立的核基因檢測方法可以準(zhǔn)確區(qū)分馬、驢、騾，解決馬、驢、騾皮張鑒定的難題。利用線粒體DNA靶標(biāo)進(jìn)行檢測，僅能區(qū)分馬和驢種源，無法將細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)來源相同的馬騾和馬區(qū)分，同樣也不能區(qū)分驢和驢騾，這樣僅從線粒體靶標(biāo)進(jìn)行檢測將會造成驢騾和驢的混淆，那么也就會造成阿膠企業(yè)在生產(chǎn)中檢測技術(shù)的問題而導(dǎo)致驢騾冒充驢的摻假。本研究中所建立的兩個二重PCR擴增體系根據(jù)需要進(jìn)行選擇應(yīng)用，如果僅僅為了區(qū)分馬、驢、騾，通過核基因二重PCR即可達(dá)到檢測目的，如果想進(jìn)一步鑒定馬騾和驢騾，可再結(jié)合線粒體基因二重PCR進(jìn)行鑒別。

阿膠是深加工產(chǎn)品，摻假阿膠多是馬皮和騾皮原料的添加，可能有以下幾種情況：(1)驢皮中摻入馬皮；(2)驢皮中同時摻入馬皮和騾皮，問題就比較復(fù)雜，因為騾是由馬和驢雜交而成，核基因組中的遺傳物質(zhì)一半來自驢一半來自馬，而線粒體呈現(xiàn)母性遺傳，馬騾的線粒體DNA來自馬，驢騾的線粒體DNA來自驢。針對這兩種摻假情況，均可以利用本研究所建立的核基因二重PCR方法進(jìn)行檢測，無論是摻入馬還是騾，均可檢測出摻入的馬源性成分。若采用線粒體DNA為靶標(biāo)進(jìn)行檢測，用馬和馬騾摻入時，通過線粒體DNA檢測可以檢出馬源性成分；若用驢騾摻入，因其線粒體DNA來自驢，這種情況下就只能檢出驢的源性成分，會產(chǎn)生漏檢的后果。在進(jìn)行阿膠中源性成分檢測時，因阿膠生產(chǎn)涉及到的不是單個皮張，當(dāng)馬、驢和騾3個物種皮張混合在一起生產(chǎn)阿膠時，無論如何都無法將騾皮與馬、驢混合皮張區(qū)分開，只能鑒定出是否有馬和驢源性成分。這不是檢測方法的問題，而是這幾個物種之間的特殊遺傳關(guān)系本身所致。

在利用核酸檢測技術(shù)進(jìn)行阿膠源性成分檢測中常遇到的一個困難是：經(jīng)過高溫熬制、高壓等加工工藝制備，DNA會受到嚴(yán)重破壞；為此，在利用阿膠樣品提取DNA時如何提高DNA的產(chǎn)量和純度是首先應(yīng)該克服的困難，本研究通過利用經(jīng)典的苯酚氯仿抽提法進(jìn)行提取，再利用小片段基因組DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，有效提高了DNA的純度。由于阿膠樣品中的DNA降解嚴(yán)重，在進(jìn)行源性成分檢測設(shè)計時，PCR擴增片段不能太長，否則擴增效率會降低；擴增片段也不能太短，如果太短會影響檢測的特異性。本研究所設(shè)計的檢測體系的擴增產(chǎn)物在150 bp左右，可有效保障阿膠中的源性成分檢測的特異性和靈敏度，進(jìn)而保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，結(jié)合馬驢核基因組和線粒體DNA中物種特異性序列建立的二重PCR檢測方法，具有操作簡單、特異性強、結(jié)果判斷直接且準(zhǔn)確等優(yōu)點，能快速、有效區(qū)分馬、驢、馬騾和驢騾以及鑒定阿膠中馬、驢源性成分，實現(xiàn)阿膠產(chǎn)品從原料到成品的監(jiān)控，為阿膠生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。

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A multiplex PCR method based on nuclear and cytoplasmic inheritance to identify the horse and donkey-derived components ofand the hide

Yang Shen, Wenjun Wang, Ming Fu,Guoqiang Xu, Xiang Zhou, Bang Liu

To identify the original components ofand its raw material hides provides a guarantee for authenticity of. It is urgent forproduction enterprises and market supervision departments to develop effective identification methods ofand hides derived from horses, donkeys, mules and hinnies. This study screened species-specific DNA sequences of nuclear and mitochondrial genomes as detection targets, designed horse and donkey specific primers and established multiple PCR identification methods for identifying the animal hides (including the horse, donkey, mule and hinny) andcontaining horse-derived and donkey-derived components. Our method can identify the horse, donkey, mule and hinny hides and horse, donkey-derived components ofwith high species specificity (no crossed amplification was observed ). The limit of detection was 0.2 ng DNA. The method developed in this study provides technical support forproduction enterprises and market supervision departments.

; nuclear gene; mitochondrial gene; multiplex PCR; horse and donkey-derived components

2020-04-20;

2020-07-10

國家科技重大專項(編號：2018ZX08012-001)資助[Supported by the National Science and Technology Major Project (No. 2018ZX08012-001)]

諶陽，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動物分子生物學(xué)與種源檢測。E-mail: shyang@webmail.hzau.edu.cn

劉榜，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動物分子生物學(xué)與育種。E-mail: liubang@mail.hzau.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-108

2020/9/17 16:41:52

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200916.1703.002.html

(責(zé)任編委: 趙方慶)