鮑莉雯，周一葉，曾凡一,

基于CRISPR/Cas9技術(shù)的β-地中海貧血和血友病基因治療研究進(jìn)展

鮑莉雯1，周一葉2，曾凡一1,2

1. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市胚胎與生殖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040 2. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海 200025

地中海貧血和血友病是由基因異常引發(fā)的常見(jiàn)的遺傳性血液病，難以根治且可遺傳給下一代，造成嚴(yán)重的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)?；蛑委煹某霈F(xiàn)為遺傳性疾病提供了新的治療方案，但自1990年第1項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)被批準(zhǔn)以來(lái)，30年間基因治療的發(fā)展并不樂(lè)觀。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，尤其具有編輯效率高、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)的第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9)的發(fā)展，基因編輯介導(dǎo)的基因治療越來(lái)越受到關(guān)注，有望根治地中海貧血和血友病等遺傳性血液病。本文綜述了近6年(2014~2020年)基于CRISPR/Cas9技術(shù)的β-地中海貧血和血友病基因治療基礎(chǔ)研究進(jìn)展，總結(jié)了基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療臨床試驗(yàn)概況，并對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)用于基因治療存在的問(wèn)題和可能的解決方案進(jìn)行探討，以期為基于CRISPR/Cas9技術(shù)的遺傳性血液病基因治療相關(guān)研究提供參考。

CRISPR/Cas9；基因治療；遺傳性血液病；臨床試驗(yàn)

遺傳性血液病是由基因異常引發(fā)的血液疾病，研究較為透徹的有地中海貧血(地貧)和血友病。在紅細(xì)胞中，血紅蛋白負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧和二氧化碳，由兩條類α珠蛋白鏈(α鏈或ξ鏈)和兩條類β珠蛋白鏈(β鏈、γ鏈或ε鏈)各結(jié)合一個(gè)血紅素組成[1]。珠蛋白基因突變會(huì)引起血紅蛋白病，包括血紅蛋白變異體和地貧，前者受累于血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常，后者則由于α鏈或類β鏈合成數(shù)量減少/缺失，致使另一條珠蛋白鏈含量相對(duì)過(guò)剩并沉積于紅細(xì)胞膜，進(jìn)而引發(fā)溶血，嚴(yán)重可導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)和患兒死亡[1,2]。根據(jù)減少/缺失的珠蛋白鏈的不同，地貧可分為α-地中海貧血(α-地貧，α鏈合成減少/缺失)、β-地中海貧血(β-地貧，β鏈合成減少/缺失)等[3,4]。在我國(guó)廣西壯族自治區(qū)α-地貧發(fā)病率高達(dá)14.95%，在廣州β-地貧發(fā)病率高達(dá)2.21%[3]。

血友病是由凝血因子基因突變導(dǎo)致相應(yīng)凝血因子嚴(yán)重缺乏而引起的出血性疾病，其中血友病A和血友病B最常見(jiàn)且均為X連鎖隱性遺傳病，分別由于凝血因子VIII基因(factor VIII,)和凝血因子IX基因(factor IX,)突變而引起[5](表1)。

對(duì)于上述遺傳性血液病，臨床上主要采取長(zhǎng)期規(guī)范輸血、成分輸血等方法進(jìn)行對(duì)癥治療[1]。這些短效的對(duì)癥療法無(wú)法根治遺傳性血液病，且長(zhǎng)期反復(fù)輸血會(huì)導(dǎo)致鐵沉積，還可能引發(fā)感染和過(guò)敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。少部分患者可通過(guò)異體骨髓或造血干細(xì)胞移植獲得長(zhǎng)效/永久的治療效果，但存在供體缺乏和免疫排斥等問(wèn)題，且費(fèi)用昂貴。隨著現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，基因治療成為最具前景的治療方案，有望根治遺傳性血液病。本文從基礎(chǔ)研究和臨床研究?jī)煞矫鎸?duì)基于CRISPR/Cas9技術(shù)的β-地貧和血友病的基因治療研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為基于CRISPR/Cas9技術(shù)的遺傳性血液病基因治療相關(guān)研究提供參考。

表1 常見(jiàn)遺傳性血液病

1 遺傳性血液病基因治療概況

1990年開(kāi)展的針對(duì)遺傳性血液病——重癥聯(lián)合免疫缺陷的基因治療試驗(yàn)被認(rèn)為是首次成功的基因治療臨床試驗(yàn)。該研究通過(guò)基因增補(bǔ)的方式，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將正常的腺苷脫氨酶(adenosine deami-nase,)基因體外導(dǎo)入患者T細(xì)胞，并隨機(jī)插入基因組，改造后的T細(xì)胞輸回患者體內(nèi)用于治療[6]。但逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)存在安全問(wèn)題，且淋巴細(xì)胞壽命短，不利于發(fā)揮長(zhǎng)效的治療效果。此后，多種病毒和非病毒載體被開(kāi)發(fā)，以提高安全性。改造的細(xì)胞也能轉(zhuǎn)為無(wú)限增殖并分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC)，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效治療。除了體外改造患者細(xì)胞的體外途徑，基因治療還可通過(guò)體內(nèi)途徑實(shí)現(xiàn)[7]，即直接將載有目的基因的載體通過(guò)靜脈輸注、肌肉注射等方式輸入患者體內(nèi)，目前血友病的基因治療主要采取體內(nèi)途徑，比如，通過(guò)門靜脈輸注將載有凝血因子VIII或凝血因子IX基因的肝趨向性腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated virus, AAV)注入患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因治療[8,9](圖1)。但體內(nèi)途徑的基因治療過(guò)程難以控制，出于安全性考慮，以造血干細(xì)胞為靶細(xì)胞的基因治療主要采取體外途徑。

對(duì)于β-地貧還可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)的方式進(jìn)行治療。上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所利用羥基脲治療β+地貧患者(患者能部分合成正常β珠蛋白鏈)，首次發(fā)現(xiàn)低劑量的羥基脲可增加正常β鏈的合成，并顯著改善患者表型[10]。此外，由于β-地貧患者體內(nèi)α鏈相對(duì)過(guò)剩，減少α鏈合成可緩解疾病癥狀，如利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)下調(diào)α-珠蛋白基因()表達(dá)可緩解β-地貧小鼠模型的貧血癥狀[11,12]。γ鏈可在功能上代償β鏈的缺失或異常，重激活γ-珠蛋白基因()表達(dá)可改善β-地貧和鐮狀細(xì)胞貧血癥狀[13,14]。

理想的基因治療是突變基因的原位修復(fù)，目前主要通過(guò)基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過(guò)第一代鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、第二代轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuc-lease, TALEN)，基因編輯技術(shù)已發(fā)展至第三代——CRISPR/Cas9，進(jìn)一步又發(fā)展出單堿基編輯技術(shù)(base editing, BE)[15,16]。雖然利用病毒載體增補(bǔ)基因是目前基因治療臨床試驗(yàn)的主流，但基于基因編輯技術(shù)的基因治療臨床試驗(yàn)項(xiàng)目正逐年增多，尤其CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因治療臨床試驗(yàn)已超過(guò)ZFN和TALEN相關(guān)臨床試驗(yàn)總數(shù)。在疾病選擇方面，因β-地貧和血友病等致病機(jī)制清楚，均為單基因病，且主要突變類型為點(diǎn)突變或移碼突變，易于實(shí)施基因治療，成為遺傳性血液病基因治療研究的主要研究對(duì)象。

圖1 CRISPR/Cas9用于遺傳性血液病基因治療的研究

sgRNA：向?qū)NA；RNP：核糖核蛋白復(fù)合體；HSPC：造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；iPSC：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

2 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的遺傳性血液病基因治療策略

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由向?qū)NA (single-guide RNA, sgRNA)和Cas9蛋白組成[17~19]，與ZFN和TALEN技術(shù)類似，CRISPR/Cas9技術(shù)同樣通過(guò)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，誘發(fā)同源重組修復(fù)(homology- directed repair, HDR)和/或非同源末端連接(non- homologous end joining, NHEJ)等DNA損傷修復(fù)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)基因編輯[19~21](圖2)。其中同源重組修復(fù)需要同源模版，DNA雙鏈斷裂按模版精確修復(fù)，只在S期晚期和G2期姐妹染色單體存在時(shí)起作用；非同源末端連接無(wú)需同源模版，無(wú)法精確修復(fù)DNA雙鏈斷裂，修復(fù)時(shí)在雙鏈斷裂處造成核苷酸插入或缺失(insertions and/or deletions, indel)，可刪除突變位點(diǎn)，或改變關(guān)鍵DNA序列引起基因表達(dá)改變，在整個(gè)細(xì)胞周期均可發(fā)生[22,23](表2)。兩種途徑的選擇主要由同源模版和細(xì)胞所處細(xì)胞周期決定，難以人為調(diào)控。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，單堿基編輯技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。單堿基編輯技術(shù)通過(guò)在無(wú)核酸酶活性的Cas9蛋白(dCas9)或只有切割DNA單鏈活性的Cas9蛋白(Cas9-nickase, Cas9n)上融合胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶，在不剪切DNA雙鏈的情況下實(shí)現(xiàn)C>T (G>A)或A>G (T>C)的單堿基編輯，不依賴同源重組修復(fù)和非同源末端連接等DNA損傷修復(fù)過(guò)程，無(wú)需同源模版便可實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的精確修復(fù)，且編輯效率最高可達(dá)100%[24~26]。

圖2 CRISPR/Cas9基因編輯原理

HDR：同源重組修復(fù)途徑；NHEJ：非同源末端連接途徑。

表2 兩種DNA損傷修復(fù)途徑

2.1 原位修復(fù)突變基因

2.1.1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的外顯子點(diǎn)突變/移碼突變的修復(fù)

外顯子點(diǎn)突變/移碼突變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或合成數(shù)量異常，引發(fā)疾病。如我國(guó)常見(jiàn)的兩種引起β-地貧的β-珠蛋白基因()突變CD41/42(-TCTT)和CD17(A>T)[27]。由于外顯子編碼蛋白質(zhì)，外顯子突變需精確修復(fù)才可恢復(fù)基因功能，因此外顯子突變必須依賴同源重組修復(fù)途徑精確修復(fù)，但在造血干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)中，同源重組效率低且不穩(wěn)定(0.045%~ 57%) (表3)[15,28~32]。靶細(xì)胞類型、靶細(xì)胞所處細(xì)胞周期、Cas9蛋白、sgRNA、同源模版以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送方式等的差異是造成同源重組效率低且不穩(wěn)定的可能原因，優(yōu)化這些參數(shù)或可提升同源重組效率。此外，2018年報(bào)道的研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)HbE/β-地貧患者(β-珠蛋白等位基因一個(gè)帶有26號(hào)密碼子G>A點(diǎn)突變，產(chǎn)生異常β鏈進(jìn)而產(chǎn)生異常血紅蛋白HbE；另一個(gè)帶有CD41/42-TCTT缺失，導(dǎo)致β鏈缺失)來(lái)源iPSC中的26號(hào)密碼子G>A點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)正確修復(fù)突變的iPSC經(jīng)紅系分化后β-珠蛋白基因mRNA和蛋白無(wú)顯著提升，作者分析可能由于β-珠蛋白基因表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄因子KLF1和BCL11A的表達(dá)水平低所致，但遺憾的是該研究未分析修復(fù)后細(xì)胞產(chǎn)生的β-珠蛋白是否為正常β-珠蛋白[32]。這提示，對(duì)基因組的修復(fù)可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的修復(fù)，導(dǎo)致無(wú)效的基因治療，因此突變修復(fù)后的細(xì)胞是否能產(chǎn)生正常的轉(zhuǎn)錄本并翻譯出足夠的功能正常的蛋白質(zhì)也是CRISPR/Cas9用于基因治療需要考慮的問(wèn)題。

表3 CRISPR/Cas9原位修復(fù)突變基因的研究

HDRa：同源重組修復(fù)；NHEJb：非同源末端連接；NAHRc：非等位同源重組；HiFi Cas9d：高保真Cas9。

2.1.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的內(nèi)含子點(diǎn)突變的修復(fù)

內(nèi)含子點(diǎn)突變可能導(dǎo)致mRNA剪接異常，影響蛋白質(zhì)翻譯，從而引發(fā)疾病。例如，導(dǎo)致β-地貧的β-珠蛋白基因IVS2-654 (C>T)突變，造成β-珠蛋白mRNA前體剪接異常，產(chǎn)生的異常mRNA (254 bp)較正常mRNA (181 bp)多出73 bp的內(nèi)含子序列，進(jìn)而影響β-珠蛋白的合成[11]。內(nèi)含子不編碼蛋白，內(nèi)含子突變只要不影響mRNA前體的剪接，便不影響基因功能，因此無(wú)需精確修復(fù)，同源重組修復(fù)和非同源末端連接兩種DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑都可恢復(fù)內(nèi)含子突變基因的功能[33~35]。通過(guò)非同源末端連接途徑修復(fù)內(nèi)含子突變附近的DNA雙鏈斷裂可高效刪除內(nèi)含子突變(效率可達(dá)98%) (表3)，恢復(fù)基因功能[34,35]。但非同源末端連接途徑產(chǎn)生的插入或缺失具有異質(zhì)性，這些插入或缺失的產(chǎn)生是否會(huì)引入新的突變，造成基因表達(dá)和蛋白功能的異常，值得進(jìn)一步研究。

2.1.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的內(nèi)含子倒位的修復(fù)

內(nèi)含子倒位是引起重型血友病A的常見(jiàn)突變類型，約50%重型血友病A患者因凝血因子VIII基因1號(hào)或22號(hào)內(nèi)含子倒位破壞了基因編碼區(qū)，進(jìn)而導(dǎo)致凝血因子VIII轉(zhuǎn)錄本的缺失，無(wú)法合成凝血因子VIII而致病[36]。非等位同源重組(non-allelic homo-logous recombination, NAHR)是導(dǎo)致凝血因子VIII基因內(nèi)含子倒位突變的原因[36]。非等位同源重組由基因組中與同源模版序列類似的非同源序列(非同源模版)介導(dǎo)，是引起DNA重排的關(guān)鍵機(jī)制之一[37,38]。凝血因子VIII基因含有的兩個(gè)1號(hào)內(nèi)含子同系物(int1h-1、int1h-2)和3個(gè)22號(hào)內(nèi)含子同系物(int22h-1、int22h-2、int22h-3)可作為非同源模版誘發(fā)凝血因子VIII基因上的DNA雙鏈斷裂經(jīng)非等位同源重組途徑錯(cuò)誤修復(fù)，產(chǎn)生內(nèi)含子倒位[36]。

研究表明模擬這一過(guò)程可修復(fù)倒位突變[39]。通過(guò)在倒位片段的兩端設(shè)計(jì)向?qū)NA，引導(dǎo)Cas9切割倒位片段兩端，誘發(fā)非等位同源重組，使倒位片段再次發(fā)生倒位，實(shí)現(xiàn)患者iPSC中內(nèi)含子倒位的修復(fù)，基因修復(fù)的細(xì)胞分化后凝血因子VIII基因表達(dá)量由0上升至正常水平的50%~120%，但修復(fù)效率只有3.7%[36]。這可能由于細(xì)胞中存在一系列抑制非等位同源重組的調(diào)控機(jī)制[40](表3)。

2.1.4 單堿基編輯技術(shù)介導(dǎo)的原位修復(fù)

對(duì)于單堿基突變引起的遺傳性血液病，除了上述利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行原位修復(fù)，還可通過(guò)單堿基編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)突變的精確修復(fù)。對(duì)β-珠蛋白基因上–28(A>G)突變進(jìn)行單堿基編輯，結(jié)果表明患者來(lái)源的造血干細(xì)胞中有36.4%的突變實(shí)現(xiàn)精確修復(fù)(C>T)，56.4%的突變被錯(cuò)誤編輯(C>G/A)，3.6%的突變未被編輯[41]。說(shuō)明在患者造血干細(xì)胞中單堿基編輯技術(shù)介導(dǎo)的精確修復(fù)效率有待提升。此外單堿基編輯技術(shù)還存在脫靶率高的問(wèn)題，研究表明單堿基編輯系統(tǒng)可造成基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平的大范圍脫靶[24]。在HEK293T細(xì)胞系中單堿基編輯系統(tǒng)BE3可導(dǎo)致近100%的RNA單核苷酸變異[42]。向脫氨酶中引入點(diǎn)突變可能是減少脫靶的有效方法[42]。

2.2 調(diào)控基因表達(dá)

α鏈和β鏈數(shù)量不平衡是導(dǎo)致地貧的直接原因，β-地貧患者的β鏈合成減少或缺失導(dǎo)致α鏈相對(duì)過(guò)剩，減少α鏈合成可緩解疾病癥狀[12,43]。對(duì)α-珠蛋白的順式調(diào)控元件進(jìn)行基因編輯，可調(diào)控α-珠蛋白的表達(dá)量。研究表明利用CRISPR/Cas9敲除β-地貧患者造血干細(xì)胞中α-珠蛋白基因增強(qiáng)子MCS-R2的核心元件，可降低α鏈的合成水平[44]。

γ鏈?zhǔn)翘貉t蛋白HbF (fetal hemoglobin, α2γ2)的組成部分，在胎兒時(shí)期高表達(dá)[43]。出生后，γ鏈逐漸被β鏈取代，人體內(nèi)主要血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)镠bA (adult hemoglobin, α2β2)[43](圖3)。重激活γ-珠蛋白基因，產(chǎn)生γ鏈與α鏈結(jié)合形成HbF，可代替HbA發(fā)揮功能，緩解α鏈相對(duì)過(guò)剩導(dǎo)致的地貧癥狀和β鏈結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的鐮狀細(xì)胞貧血癥狀[45~48]。

γ-珠蛋白基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等多種元件調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL11A等是成人紅系細(xì)胞中γ-珠蛋白基因低表達(dá)的重要影響因素[46,49]。BCL11A可以結(jié)合γ-珠蛋白基因的近端啟動(dòng)子，并抑制γ-珠蛋白基因表達(dá)。由于BCL11A在淋巴細(xì)胞發(fā)育中有重要調(diào)控作用，敲除造血干細(xì)胞中的雖可顯著提升其分化的紅系細(xì)胞的γ-珠蛋白基因的表達(dá)水平，但會(huì)影響淋巴細(xì)胞的成熟[50,51]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)紅系特異增強(qiáng)子，在造血干細(xì)胞中敲除該增強(qiáng)子的DNA酶I超敏位點(diǎn)(DNase I hypersensitive site, DHS) +58可特異下調(diào)紅系細(xì)胞中的表達(dá)，而不影響其他類型細(xì)胞，且效果與直接敲除相似[45,49]。利用CRISPR/Cas9在β-地貧和鐮狀細(xì)胞貧血患者的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中敲除此位點(diǎn)，其分化后的紅系細(xì)胞可產(chǎn)生治療水平的胎兒血紅蛋白[45](表4)?；谶@一思路，相關(guān)臨床試驗(yàn)已展開(kāi)(表5)。

此外，重激活γ-珠蛋白基因還可采取其他方法，如破壞γ-珠蛋白基因近端啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL11A或ZBTB7A的結(jié)合位點(diǎn)[46]，其中BCL11A結(jié)合位點(diǎn)(TGACCA：?jiǎn)?dòng)子的?114至?119)是基因編輯的理想靶點(diǎn)，在β-地貧患者的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中利用CRISPR/Cas9破壞該位點(diǎn)，平均編輯效率可達(dá)85%，編輯后的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞經(jīng)紅系分化，γ-珠蛋白的mRNA可達(dá)α-珠蛋白的126%，或利用單堿基編輯器(hAPOBEC3A-Cas9n, hA3A-BE3)破壞該位點(diǎn)，可使γ-珠蛋白mRNA與α-珠蛋白mRNA的比值由~6.8%升至~44.2%[52]；模擬引起遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合癥的–113A>G突變，在γ-珠蛋白基因近端啟動(dòng)子上創(chuàng)造新的轉(zhuǎn)錄激活因子GATA1結(jié)合位點(diǎn)[47]；敲除β-珠蛋白基因簇上可能的γ-珠蛋白基因抑制因子區(qū)域[48]；下調(diào)血紅素調(diào)節(jié)抑制因子(heme-regulated inhibitor, HRI)進(jìn)而引起表達(dá)下調(diào)[53]等(表4)。

圖3 血紅蛋白演變示意圖

表4 基因表達(dá)調(diào)控: CRISPR/Cas9體外重激活HBG的基礎(chǔ)研究

HUDER-2a：永生化人CD34+HSPC來(lái)源的紅細(xì)胞系；SCD HSPCb：鐮狀細(xì)胞貧血癥患者造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞；SCD CD34+細(xì)胞c：鐮狀細(xì)胞貧血癥患者CD34+細(xì)胞；d：血紅素調(diào)節(jié)抑制因子基因；N/Ae：無(wú)數(shù)據(jù)。

表5 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療臨床試驗(yàn)

續(xù)表5

HSPCa：造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞；b：B細(xì)胞淋巴瘤因子11A；CD19c：B細(xì)胞表面抗原；CAR-Td：嵌合抗原受體T細(xì)胞；e：絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶1基因；TCRf：T細(xì)胞受體；MHC Ig：主要組織相容性復(fù)合體；h：β-2-微球蛋白基因；CD7i：白細(xì)胞分化抗原之一；CD28j：白細(xì)胞分化抗原之一；BCMAk：腫瘤壞死因子受體超家族成員17；NY-ESO-1l：癌癥–睪丸抗原1；m：程序性細(xì)胞死亡蛋白1基因；EVBn：Epstein-Barr virus，EB病毒；o：細(xì)胞因子誘導(dǎo)含SH2蛋白基因；p：C-C基序趨化因子受體5基因；q：賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2D基因；IVS26r：中心體蛋白290 26號(hào)內(nèi)含子；N/As：無(wú)數(shù)據(jù)；NCT編號(hào)t：每一NCT編號(hào)附有相應(yīng)網(wǎng)頁(yè)鏈接，點(diǎn)擊鏈接或在https://clinicaltrials.gov上搜索相應(yīng)NCT編號(hào)可見(jiàn)各研究詳情。

3 CRISPR/Cas9治療策略與其他基因療法的比較

對(duì)于遺傳性血液病，目前利用病毒載體增補(bǔ)基因的基因治療方法仍是臨床試驗(yàn)的主流，尤其安全性更高、包裝能力更強(qiáng)的慢病毒載體應(yīng)用最為廣泛。2018年報(bào)道的臨床試驗(yàn)利用慢病毒載體將β-珠蛋白基因?qū)牖颊咴煅杉?xì)胞，對(duì)22例輸血依賴型地貧患者進(jìn)行基因治療，其中12例非β0/β0基因型患者停止接受紅細(xì)胞輸入，另9例β0/β0基因型或雙IVS1-110突變患者年輸血量中位值降低了73%[54]，證實(shí)了通過(guò)增補(bǔ)基因治療β-地貧的可行性。但基因的隨機(jī)整合存在插入突變等安全問(wèn)題[55]，因此與整合型病毒介導(dǎo)的基因增補(bǔ)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)能直接靶向突變位點(diǎn)，目的性強(qiáng)。

采用非整合型病毒可降低隨機(jī)整合引起的安全問(wèn)題，如腺相關(guān)病毒，一般在胞內(nèi)以附加體形式存在，基本不整合到基因組中，但其導(dǎo)入基因的長(zhǎng)期表達(dá)效果不理想[56]。將腺相關(guān)病毒載體注射到體內(nèi)增補(bǔ)凝血因子VIII或凝血因子IX基因是血友病主要的基因治療方法[9]。對(duì)于血友病B，2017年報(bào)道的臨床試驗(yàn)中凝血因子IX平均促凝活性水平可達(dá)33.7±18.5%，持續(xù)時(shí)間超1年[9,57]；另一項(xiàng)研究中凝血因子IX表達(dá)時(shí)間可達(dá)8年甚至更久[9]。在血友病A基因治療臨床試驗(yàn)中，凝血因子VIII促凝活性水平可達(dá)52.3%，表達(dá)時(shí)間可達(dá)3年[9]。但隨著細(xì)胞分裂，非整合型的腺相關(guān)病毒載體可能被丟失[56]。理想狀態(tài)下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需短暫存在于待編輯的細(xì)胞中便可實(shí)現(xiàn)永久的靶向基因修復(fù)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)顳靜脈注射，將載有CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的腺相關(guān)病毒載體注入凝血因子IX敲除的小鼠模型中，以實(shí)現(xiàn)人凝血因子IX的敲入[58]。治療后，小鼠體內(nèi)人凝血因子IX活性達(dá)正常水平的120%~ 160%，并至少可持續(xù)32周[58]。目前尚無(wú)基于CRISPR/ Cas9技術(shù)的血友病基因治療相關(guān)臨床試驗(yàn)。

與其他基因編輯技術(shù)相比CRISPR/Cas9技術(shù)主要?jiǎng)僭趹?yīng)用面廣、易操作、效率高。不同于ZFN和TALEN需通過(guò)合成特殊蛋白識(shí)別靶DNA，CRISPR/ Cas9只需借助一段22nt的與DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的向?qū)NA，避免了復(fù)雜且昂貴的蛋白設(shè)計(jì)合成過(guò)程，且向?qū)NA設(shè)計(jì)合成靈活簡(jiǎn)便，CRISPR/Cas9系統(tǒng)裝配簡(jiǎn)單，使得CRISPR/Cas9技術(shù)迅速得到廣泛應(yīng)用，包括用于基因治療[59](表6)。

單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別機(jī)制與CRISPR/ Cas9相同，不同的是，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯依賴同源重組修復(fù)和非同源末端連接等DNA損傷修復(fù)途徑對(duì)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)[16]。同源重組修復(fù)雖能精確修復(fù)突變但效率低，非同源末端連接會(huì)造成核苷酸插入或缺失，可能引入新的突變[16]。單堿基編輯技術(shù)不造成DNA雙鏈斷裂，其介導(dǎo)的基因編輯不依賴同源重組修復(fù)和非同源末端連接等DNA損傷修復(fù)過(guò)程，不會(huì)造成核苷酸插入或缺失，且對(duì)單個(gè)堿基的精確編輯效率高，可達(dá)100%[16,25,26]。但單堿基編輯系統(tǒng)只能實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的編輯，而CRISPR/Cas9除可實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的編輯外，還可實(shí)現(xiàn)DNA大片段的插入或敲除。

4 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療臨床研究

2016年中國(guó)開(kāi)展了世界首個(gè)基于CRISPR/Cas9技術(shù)針對(duì)轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的基因治療臨床試驗(yàn)[60]。截止至2020年6月，基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療臨床試驗(yàn)共26項(xiàng)(表5)，涉及遺傳性血液病、血液腫瘤、實(shí)體瘤、感染性疾病和罕見(jiàn)病。對(duì)于血液腫瘤和實(shí)體瘤，CRISPR/Cas9主要用于編輯嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR) T細(xì)胞(CAR-T cell)和患者自體T細(xì)胞，以提高治療的安全性和有效性。2020年5月上述首個(gè)基于CRISPR/ Cas9技術(shù)的基因治療臨床試驗(yàn)(NCT02793856)公布了最新結(jié)果[61]。該研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)體外破壞患者自體T細(xì)胞的基因，以激活T細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞，二代測(cè)序結(jié)果表明編輯效率中位數(shù)為5.81% (范圍0.42%~24.85%)，脫靶率中位數(shù)為0.05% (范圍0~0.25%)[61]。12名晚期非小細(xì)胞肺癌患者接受基因編輯T細(xì)胞治療，無(wú)患者獲得病情的部分緩解，2名患者獲得病情穩(wěn)定，未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[61]。另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)針對(duì)癌癥–睪丸抗原NY-ESO-1和/或LAGE-1陽(yáng)性腫瘤(NCT03399448)，通過(guò)慢病毒載體將靶向NY-ESO-1和LAGE-1的T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor, TCR)編碼序列導(dǎo)入患者自體T細(xì)胞，使之靶向NY-ESO-1和/或LAGE-1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除T細(xì)胞內(nèi)源TCR和，以增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷力[62]。2名難治性晚期骨髓瘤患者和1名難治性靜態(tài)肉瘤患者接受基因編輯T細(xì)胞輸注后，2名患者獲得病情穩(wěn)定，未見(jiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征或細(xì)胞輸注引起的明顯副作用[62]。感染性疾病包括人乳頭瘤病毒感染和艾滋病。對(duì)于前者，研究利用CRISPR/Cas9靶向破壞人乳頭瘤病毒的E6和E7基因，使病毒喪失感染能力。相反，艾滋病的治療試圖利用CRISPR/Cas9靶向破壞編碼人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)主要受體蛋白的基因，使HIV-1無(wú)法感染淋巴細(xì)胞。2019年該臨床試驗(yàn)(NCT03164135)公布研究結(jié)果，1名合并有急性淋巴細(xì)胞白血病的艾滋病患者接受基因敲除的異體CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞輸注后急性淋巴白血病得到完全緩解，攜帶突變的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在患者體內(nèi)可長(zhǎng)期存活達(dá)19個(gè)月，但不足以治愈HIV-1感染導(dǎo)致的艾滋病，研究未見(jiàn)基因編輯相關(guān)的不良反應(yīng)[63]。上述臨床研究結(jié)果顯示了基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療的可行性及安全性，但有效性有待提升。罕見(jiàn)病有歌舞伎綜合征1和Leber先天性黑蒙10型(Leber congenital amaurosis type 10, LCA-10)，其中針對(duì)Leber先天性黑蒙10型的臨床試驗(yàn)是第一項(xiàng)也是目前唯一一項(xiàng)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的體內(nèi)途徑的基因治療臨床試驗(yàn)[64]。

表6 基因編輯技術(shù)對(duì)比

總體來(lái)看，基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療臨床試驗(yàn)以體外途徑為主，主要集中于癌腫治療(20項(xiàng))，可能由于癌腫往往嚴(yán)重威脅患者生命，癌腫的治療是目前臨床上迫切需要解決的問(wèn)題。從疾病發(fā)生系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，則主要集中于血液系統(tǒng)疾病(13項(xiàng))，這可能得益于造血干細(xì)胞移植的成功和CAR-T細(xì)胞療法在血液腫瘤中取得了較好的臨床效果[65]。在遺傳性血液病方面，目前臨床研究數(shù)相對(duì)較少(4項(xiàng))，可能由于遺傳性血液病目前已有療法有一定效果，且CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的缺陷暫未很好解決，目前相關(guān)臨床研究結(jié)果尚未發(fā)布。

5 結(jié)語(yǔ)和展望

CRISPR/Cas9技術(shù)走向臨床展現(xiàn)了其用于基因治療的良好前景，但其存在的問(wèn)題仍不容忽視。(1)安全性問(wèn)題。研究表明CRISPR/Cas9技術(shù)存在嚴(yán)重脫靶效應(yīng)，脫靶率可達(dá)靶向編輯效率的5.6%~125%[66]。最新研究報(bào)道Cas9蛋白可能多次切割DNA，造成百萬(wàn)堿基級(jí)的染色體末端大片段缺失[67]。(2)精確編輯效率低。(3)編輯產(chǎn)物異質(zhì)性高。DNA雙鏈斷裂經(jīng)非同源末端連接修復(fù)時(shí)可產(chǎn)生40種[35]，甚至更多的基因型，導(dǎo)致基因編輯產(chǎn)物異質(zhì)性高，難以進(jìn)行質(zhì)控。

針對(duì)這些問(wèn)題，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究和解決。

(1)改造遞送系統(tǒng)提高編輯效率，降低脫靶率。質(zhì)粒、病毒、mRNA和核糖核蛋白復(fù)合體(ribonuc-leoprotein, RNP)是依次開(kāi)發(fā)出的四種CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)[68](圖1)。最新的核糖核蛋白復(fù)合體由向?qū)NA與Cas9蛋白體外孵育組裝而成，進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮短時(shí)的基因編輯功能，有較高的基因編輯效率和更低的細(xì)胞毒性和脫靶率，更適用于基因治療，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有待進(jìn)一步提升[45,68,69]。上述3項(xiàng)臨床研究中(NCT02793856、NCT03399448、NCT03164135)有兩項(xiàng)(NCT03399448、NCT03164135)使用核糖核蛋白復(fù)合體遞送系統(tǒng)。

(2)改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)提高編輯效率，降低脫靶率。在改造向?qū)NA方面，對(duì)于同一靶點(diǎn)不同向?qū)NA介導(dǎo)的基因編輯效率和脫靶率差異顯著[70]，目前主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選的方法，篩出效率最高、脫靶率最低的向?qū)NA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。針對(duì)人和小鼠基因組，科學(xué)家基于大量實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了向?qū)NA庫(kù)，用于評(píng)估向?qū)NA的編輯效果[70]；對(duì)于mRNA和核糖核蛋白復(fù)合體遞送系統(tǒng)，向?qū)NA的穩(wěn)定性對(duì)基因編輯效率影響較大，化學(xué)修飾向?qū)NA可提升向?qū)NA穩(wěn)定性，防止其過(guò)快降解，提升基因編輯效率，將插入或缺失(indel)率從2.4%提升至83.3%，同源重組效率從~15%提升至50%[71]。在改造Cas9蛋白方面，改造Cas9蛋白的氨基酸組成可提高靶向編輯率:總編輯率的比值，如p.R691A單點(diǎn)突變的HiFi Cas9，其總編輯效率與野生型Cas9相近，但on-target效率可達(dá)總編輯效率的99%，顯著高于野生型的28%~72%，且HiFi Cas9較野生型Cas9脫靶率降低近20倍[72]；在Cas9蛋白上融合核定位序列，輔助Cas9蛋白入核，也可提升基因編輯效率[45]。

(3)闡明DNA損傷修復(fù)機(jī)制。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯依賴DNA損傷修復(fù)機(jī)制，目前主要考慮同源重組和非同源末端連接。研究表明，微同源末端連接(microhomology-mediated end joining, MMEJ)是DNA損傷修復(fù)的又一重要途徑，為基因編輯介導(dǎo)的基因治療策略提供了更多可能[73]。

(4)找尋合適的基因編輯靶點(diǎn)。基因編輯安全實(shí)施的關(guān)鍵是找到特異且易編輯的靶點(diǎn)，而找尋靶點(diǎn)的基礎(chǔ)是闡明疾病致病機(jī)制，使得基因治療靶點(diǎn)不限于突變位點(diǎn)，而是可以拓展到突變基因的上下游或替代/補(bǔ)償途徑去尋找最合適的編輯靶點(diǎn)，比如，對(duì)于β-地貧和鐮狀細(xì)胞貧血，可通過(guò)重激活內(nèi)源γ-珠蛋白基因，緩解疾病癥狀。該方法不受突變位點(diǎn)影響，適用范圍廣，為其他有類似調(diào)節(jié)機(jī)制的疾病提供了基因治療的新思路?；蛘{(diào)控元件作為編輯靶點(diǎn)是近兩年的研究趨勢(shì)，越來(lái)越多的研究表明對(duì)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等進(jìn)行編輯可有效調(diào)控基因表達(dá)，尤其對(duì)于譜系特異的調(diào)控元件，安全性更高。

(5)發(fā)展造血干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)。血液病的基因治療離不開(kāi)干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。目前血液病治療和臨床研究主要采用造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞及其分化出的T淋巴細(xì)胞。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的應(yīng)用仍存在難以體外增殖、體外培養(yǎng)體系不成熟、已有分子標(biāo)記特異性不強(qiáng)、同源重組修復(fù)效率低且不穩(wěn)定等問(wèn)題?；蚓庉嫾?xì)胞移植至免疫缺陷小鼠后編輯效率降低可能就由于其中混有未編輯的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞[45]，而目前基因編輯效率難以實(shí)現(xiàn)100%，也難以分選出正確編輯的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。但造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞安全性好，移植技術(shù)成熟，是基因治療靶細(xì)胞的首選。

(6)發(fā)展誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)。2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的問(wèn)世為遺傳病基因治療研究提供了良好的細(xì)胞模型，患者來(lái)源的iPSC與患者遺傳背景一致，無(wú)倫理問(wèn)題，且可在體外大量擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9在na ??ve iPSC中的編輯效率高出primed iPSC近兩倍[74]；在iPSC培養(yǎng)物中添加小分子化合物，同源重組修復(fù)效率可從6%提升至54%，同時(shí)抑制非同源末端連接的發(fā)生，這些研究可為造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞基因編輯提供指導(dǎo)[30]。iPSC具有分化為三胚層細(xì)胞的潛能，但未分化的iPSC有致瘤風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)法直接用于基因治療[75]。將其分化為造血干細(xì)胞等成體干細(xì)胞或可解決此問(wèn)題。目前將iPSC分化為造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的分化體系尚不成熟，分化出的造血干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠中難以長(zhǎng)期植入[76]，基因組不穩(wěn)定，易發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化[77]。此外，雖然實(shí)驗(yàn)室中突變修復(fù)后的β-地貧患者來(lái)源iPSC紅系分化效率提高且分化所得紅系細(xì)胞β-珠蛋白表達(dá)提升[15,28,29]，但多數(shù)研究中突變未修復(fù)iPSC和突變修復(fù)iPSC來(lái)源的紅系細(xì)胞均主要表達(dá)γ-珠蛋白[15,29,78]，難以模擬正常人紅系細(xì)胞主要表達(dá)β-珠蛋白的真實(shí)情況。

(7)其他。目前CRISPR/Cas9用于基因治療的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、臨床療效、不良反應(yīng)等尚不明確，需待進(jìn)一步的臨床研究?；蚓庉嫾夹g(shù)用于基因治療的相關(guān)法律法規(guī)也有待進(jìn)一步完善。

綜上所述，基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因治療研究主要集中于血液系統(tǒng)疾病，包括血液腫瘤和遺傳性血液病，尤其適用于主要由單基因點(diǎn)突變或移碼突變?cè)斐傻摩?地貧等疾病，最安全有效的細(xì)胞是患者自體造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，更安全的途徑是體外途徑。在體外造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞處于G0期，主要采取非同源末端連接的方式修復(fù)DNA雙鏈斷裂，因此CRISPR/Cas9雖可修復(fù)多種類型突變，但更適用于內(nèi)含子突變的刪除和基因表達(dá)調(diào)控，尤其利用CRISPR/Cas9重激活γ-珠蛋白基因表達(dá)的基因治療方式，已開(kāi)始臨床研究。但通過(guò)非同源末端連接的方式實(shí)現(xiàn)基因編輯終究無(wú)法精確修復(fù)基因突變，潛在的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法評(píng)估，因此最理想最希望實(shí)現(xiàn)的仍是通過(guò)同源重組修復(fù)精確修復(fù)基因突變，提高同源重組修復(fù)效率應(yīng)是今后CRISPR/Cas9用于疾病治療的重點(diǎn)研究方向。此外，單堿基編輯技術(shù)能實(shí)現(xiàn)高效且精確的單堿基編輯，在單堿基突變引起的疾病中有巨大的應(yīng)用前景，可與CRISPR/Cas9技術(shù)互為補(bǔ)充。目前單堿基編輯技術(shù)進(jìn)入臨床要解決的首要問(wèn)題亦是脫靶率高。相信隨著上述問(wèn)題的解決，基于CRISPR技術(shù)的基因治療會(huì)成為安全且高效的基因治療方法，為治愈遺傳性疾病帶來(lái)希望。

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Advances in gene therapy for β-thalassemia and hemophilia based on the CRISPR/Cas9 technology

Liwen Bao1, Yiye Zhou2, Fanyi Zeng1,2

Thalassemia and hemophilia are common inherited blood disorders caused by genetic abnormalities. These diseases are difficult to cure and can be inherited to the next generation, causing severe family and social burden. The emergence of gene therapy provides a new treatment for genetic diseases. However, since its first clinical trial in 1990, the development of gene therapy has not been as optimistic in the past three decades as one could hope. The development of gene-editing technology, particularly the third generation gene-editing technology CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9), has given hope in such therapeutic approach for having advantages in high editing efficiency, simple operation, and low cost. Gene editing-mediated gene therapy has thus received increasing attention from the biomedical community. It has shown promises for the treatment of inherited blood disorders, such as thalassemia and hemophilia. This paper reviews the fundamental research progress of gene therapy for β-thalassemia and hemophilia based on CRISPR/Cas9 technology in the past six years. It also summarizes the CRISPR/Cas9-based clinical trials of gene therapy. The problems and possible solutions to this technology for gene therapy are also discussed, thereby providing a reference for the research on gene therapy of inherited blood disorders based on CRISPR/Cas9 technology.

CRISPR/Cas9; gene therapy; inherited blood disorders; clinical trials

2020-04-21;

2020-08-25

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2016YFC1000503)，上海市重中之重重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(編號(hào)：2017ZZ02019)，上海市臨床重點(diǎn)?？祈?xiàng)目(編號(hào)：shslczdzk05705) [Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFC1000503), Shanghai Key Disciplines Program (No. 2017ZZ02019), Key Clinical Specialty Projects in Shanghai (No. shslczdzk05705)]

鮑莉雯，碩士研究生，專業(yè)方向：生物學(xué)。E-mail: blwbaoliwen@163.com

曾凡一，博士，研究員，研究方向：遺傳學(xué)。E-mail: fzeng@vip.163.com

10.16288/j.yczz.20-110

2020/9/16 16:00:01

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200915.1721.002.html

(責(zé)任編委: 徐湘民)