摘要：蔬菜農(nóng)藥快速檢測(cè)酶抑制技術(shù)在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中常出現(xiàn)空白值過(guò)低、樣品吸光值過(guò)高、抑制率值為負(fù)數(shù)，以及假陰性、假陽(yáng)性問(wèn)題。作者通過(guò)半年來(lái)近300個(gè)不同種類蔬菜樣品的檢測(cè)和大量加標(biāo)對(duì)比試驗(yàn)，對(duì)以上問(wèn)題給出了相應(yīng)說(shuō)明，提出了相應(yīng)辦法。

關(guān)鍵詞：蔬菜;農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)酶抑制技術(shù);原理;試劑配制

食品安全越來(lái)越引起世界各國(guó)的重視，它與人民健康有著直接的聯(lián)系，因此，世界各國(guó)在嚴(yán)格控制農(nóng)藥施用的同時(shí)加大對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量監(jiān)測(cè)檢測(cè)的力度。在我國(guó)，“無(wú)公害蔬菜”“菜籃子”工程也已納入到各級(jí)政府的日常工作中。農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)酶抑制技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)效率高、檢測(cè)成本低、對(duì)人員技術(shù)水平要求低、易于在基層（生產(chǎn)基地、批發(fā)市場(chǎng)）推廣使用等優(yōu)勢(shì)，是當(dāng)前我國(guó)控制農(nóng)產(chǎn)品中高毒農(nóng)藥殘留的使用最廣泛的一種方法。但是在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，常出現(xiàn)空白值過(guò)低、樣品吸光值過(guò)高、抑制率值為負(fù)數(shù)，以及假陰性、假陽(yáng)性問(wèn)題。“錯(cuò)檢”“錯(cuò)判”屢屢發(fā)生。這不僅使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者遭受損失，消費(fèi)者對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全難以放心，同時(shí)也給農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管帶來(lái)困擾。筆者通過(guò)半年來(lái)近300個(gè)不同種類蔬菜樣品的檢測(cè)和大量加標(biāo)對(duì)比試驗(yàn)，從檢測(cè)原理、藥品配制及樣品前處理、上機(jī)檢測(cè)、試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明、儀器選擇等五部分，對(duì)如何解釋、解決以上問(wèn)題加以說(shuō)明。

1 檢測(cè)原理

農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)酶抑制技術(shù)是根據(jù)有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有抑制動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶活性，造成其神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的過(guò)渡積累，引發(fā)神經(jīng)傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致動(dòng)物中毒致死這一原理開(kāi)發(fā)出來(lái)的。即如果農(nóng)產(chǎn)品的提取液中不含有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥或農(nóng)藥殘留量很低，酶活性就不會(huì)被抑制，底物就會(huì)被全部或部分水解，其產(chǎn)物與顯色劑產(chǎn)生顏色;反之，則不顯色或顯色變化范圍較小，應(yīng)用農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀測(cè)定其吸光值隨時(shí)間變化，便可得出抑制率，據(jù)此判定農(nóng)藥殘留情況。此項(xiàng)技術(shù)實(shí)質(zhì)就是一個(gè)典型的酶促反應(yīng)，因此，其受酶的質(zhì)量和酶促反應(yīng)條件影響巨大。對(duì)影響酶促反應(yīng)的溫度、酸堿度、氧化還原電位等關(guān)鍵參數(shù)予以控制，嚴(yán)格把握酶的種類、純度、活性和酶濃度等關(guān)鍵核心要素是保證分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性的必由之路。

2 試劑配制和樣品前處理

2.1 試劑配制

試劑配制包括提取劑、酶、底物及顯色劑。其中提取劑配制至關(guān)重要，要注意緩沖鹽的純度差別對(duì)緩沖液pH值的影響，必要時(shí)應(yīng)對(duì)其pH加以校正至8.0。酶液、底物和顯色劑應(yīng)注意保存和使用溫度，防止變質(zhì)失效。實(shí)驗(yàn)表明，丁酰膽堿酯酶溶液在溫度23.5℃和濕度70%條件下，酶快速失活，5小時(shí)后基本失活，24小時(shí)后⊿AC≈0.0，酶完全失活。此外還應(yīng)注意使用前酶活性的驗(yàn)證。如果空白值⊿AC<0.4，即表明酶活性降低，在適當(dāng)加大酶的用量后仍未達(dá)到要求，就必須對(duì)酶進(jìn)行更換，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2 樣品前處理

樣品提取須按農(nóng)產(chǎn)品種類選擇適宜的檢測(cè)部位。葉菜類蔬菜應(yīng)去腐、枯、蕊葉，并選擇不同植株的葉片;果菜、豆菜類蔬菜應(yīng)從表皮至果肉1～1.5厘米處取樣，果肉不要取的過(guò)多;葉綠素等色素較高的農(nóng)產(chǎn)品取樣時(shí)要避免切的過(guò)碎，降低色素干擾;對(duì)茄子等易氧化農(nóng)產(chǎn)品切碎后要立即加入提取劑，避免氧化致使提取液顏色加深，導(dǎo)致樣品本底吸光值升高。樣品制備最好選擇5毫升培養(yǎng)管，大規(guī)格的培養(yǎng)管容易造成微量的試劑殘留在管壁上，無(wú)法完全進(jìn)入到培養(yǎng)液中，引起誤差。與此同時(shí)，也應(yīng)保證培養(yǎng)箱的溫度和培養(yǎng)時(shí)間在37.0～38.0℃和30分鐘。

3 上機(jī)檢測(cè)

上機(jī)檢測(cè)必須要保證儀器穩(wěn)定、比色杯無(wú)色差，并控制操作時(shí)間。在RP508上分別對(duì)丁酰膽堿酯酶、乙酰膽堿酯酶做平行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明（見(jiàn)表1），使用丁酰膽堿酯酶的空白⊿AC隨時(shí)間變化大，其活性較高，加入底物后反應(yīng)快速，所以，應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間，否則隨著Ai、Af值不斷升高，⊿AC值將迅速減小，影響檢測(cè)的靈敏度;與此相反，用乙酰膽堿酯酶的空白⊿AC受操作時(shí)間影響不大。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 空白值

從300個(gè)樣品近12個(gè)批次的檢測(cè)和百余個(gè)對(duì)比試驗(yàn)中得出，用丁酰膽堿酯酶，⊿AC的正常值為0.620左右（見(jiàn)表2）。當(dāng)然，不同的酶在不同型號(hào)儀器上因儀器設(shè)計(jì)差異、檢測(cè)條件不同和酶活性差異，其空白值是不同的。

4.2 吸光值

樣品吸光值（Ai、Af）偏高是檢測(cè)中常見(jiàn)的問(wèn)題。酶活性降低、樣品本底顏色深和反應(yīng)中化學(xué)、物理干擾是其產(chǎn)生的根本原因。酶失效會(huì)引起其顏色加深（由乳白色變?yōu)辄S色）、樣品色素含量高、提取液中含有樣品組織液等都會(huì)使透過(guò)光被額外的吸收或被散色，使透光率降低，在吸光度上表現(xiàn)為值的增大。通過(guò)對(duì)用丁酰膽堿酯酶在VIS7220SC上所做的大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)的匯總得出，對(duì)于殘留農(nóng)藥低于檢出線的樣品的Ai、Af分別按正態(tài)分布統(tǒng)計(jì)得出：Ai=0.6±0.1、Af =1.2±0.1應(yīng)為正常值。

4.3 抑制率為負(fù)

樣品檢測(cè)結(jié)果偶爾出現(xiàn)負(fù)值，且負(fù)值誤差在-10%以內(nèi)，是可以被接受的。其產(chǎn)生原因主要是操作誤差。酶分解底物，分解物再與顯色劑結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程迅速，操作者操作不熟練就會(huì)產(chǎn)生這樣的人為誤差。但隨著操作者操作熟練度的提高，其是可以避免的。

4.4 假陽(yáng)性與假陰性

假陽(yáng)性是因酶活性降低或失活，使底物不能被水解，無(wú)法與顯色劑結(jié)合顯色造成的。假陰性是因?yàn)樘囟ㄞr(nóng)藥對(duì)某種酶抑制作用很小或無(wú)作用而產(chǎn)生的，表現(xiàn)出無(wú)農(nóng)藥的假象。除此，化學(xué)干擾在假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題上也是值得關(guān)注的。如植物細(xì)胞中大量的微粒體氧化酶和解毒酶，這些酶可以把對(duì)硫磷、樂(lè)果等分別氧化成毒性更高的對(duì)氧化磷和氧化樂(lè)果;但大部分氧化酶、水解酶都可以快速把眾多殺蟲(chóng)劑通過(guò)羥基化、裂解等方式，轉(zhuǎn)化為低毒甚至無(wú)毒的化合物。因此，只能通過(guò)選擇有較好活性、較強(qiáng)選擇性的酶來(lái)盡量減少此類問(wèn)題的發(fā)生。至于化學(xué)干擾的排除目前還沒(méi)有很好的解決辦法。

5? 儀器的選擇

當(dāng)今市場(chǎng)上銷售的農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀形形色色，這些儀器雖然在功能上、自動(dòng)化程度上有所差別，但從儀器穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度上看，其中的差別并不是很明顯。因此，在儀器的選擇上應(yīng)根據(jù)各地的經(jīng)濟(jì)狀況，檢測(cè)人員的技術(shù)水平來(lái)挑選適合本地實(shí)際檢測(cè)工作的儀器型號(hào)。

作者簡(jiǎn)介：郝明（1980-），男，高級(jí)農(nóng)藝師。從事農(nóng)業(yè)環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究工作。