簡華鋒　祖盤玉　李洪林　牟騰慧　龍廣麗　饒永超　林家棟　李輝　張福平

摘要：【目的】揭示刺豚鼠信號(hào)蛋白基因（ASIP）SNP位點(diǎn)突變與不同雞種羽色差異形成機(jī)制的關(guān)聯(lián)性，篩選出與雞種羽色相關(guān)的輔助育種分子標(biāo)記?！痉椒ā繀⒖糔CBI已公布的紅色原雞ASIP基因序列（登錄號(hào)NC_006107.5），運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，以羅曼蛋雞、泰和烏骨雞、興義矮腳雞白羽系、赤水烏骨雞、貴州黃雞和瑤山雞為研究對(duì)象，通過DNA混合池及PCR直接測(cè)序法篩選不同羽色雞種ASIP基因SNP位點(diǎn);估算各SNP位點(diǎn)等位基因頻率后，使用RNAfold、NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究不同羽色雞種ASIP基因SNP位點(diǎn)突變對(duì)基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、ASIP蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)及其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】從6個(gè)雞種ASIP基因中檢測(cè)到7個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T。其中，Exon-2-T3203G只出現(xiàn)在羅曼蛋雞上，Exon-2-G3287A只出現(xiàn)在瑤山雞上。Exon-2-T168C只出現(xiàn)在貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系且位于編碼區(qū)，該位點(diǎn)突變導(dǎo)致編碼氨基酸改變[蘇氨酸（Thr）→甲硫氨酸（Met）]，且能導(dǎo)致ASIP基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，最小自由能增加，穩(wěn)定性降低。Exon-2-T168C位點(diǎn)突變還導(dǎo)致ASIP蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)數(shù)量和位置發(fā)生改變，但糖基化位點(diǎn)未發(fā)生改變;Exon-2-T168C位點(diǎn)突變后ASIP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈的占比增加，而無規(guī)則卷曲占比降低，且蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】在貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系A(chǔ)SIP基因上檢測(cè)到Exon-2-T168C位點(diǎn)，且該位點(diǎn)突變能引起ASIP基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)數(shù)量和位置及ASIP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，但并不是影響貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系羽色差異的內(nèi)在機(jī)制。

關(guān)鍵詞： 雞;羽色;刺豚鼠信號(hào)蛋白基因（ASIP）;SNP位點(diǎn);生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S831.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）08-1823-09

Screening of SNP locus and its bioinformatics analysis of ASIP gene in different chicken breeds with various feather colors

JIAN Hua-feng1，2，3， ZU Pan-yu1，2，3， LI Hong-lin4， MOU Teng-hui1，2，3， LONG Guang-li1，2，3，

RAO Yong-chao1，2，3， LIN Jia-dong1，2， LI Hui1，2， ZHANG Fu-ping1，2，3*

（1College of Animal Science， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in Guizhou， Guiyang? 550025， China; 2Institute of Poultry， Guizhou University， Guiyang? 550025， China;

3Scientific Research Chicken Farm of Guizhou University， Guiyang? 550025， China; 4Guizhou

Agriculture Vocational College， Guiyang? 551400， China）

Abstract：【Objective】In order to reveal the association between the agouti signal protein（ASIP） gene SNP mutation and the formation mechanism of the feather color difference in different chicken breeds， and screen out auxiliary breeding molecular markers related to the feather color of chicken breeds. 【Method】According to the ASIP gene sequence of the red rock fowl（accession number NC_006107.5） published by NCBIand design specific primers by Primer Premier 5.0，Roman layer chicken， Taihe silky chicken， Xingyi bantam white feather line， Chishui black-bone chicken， Guizhou yellow chicken and Yaoshan chicken were chosen as research objects. The SNP locus of ASIP gene in different feather color chicken breeds were screened by DNA mixing pool and PCR direct sequencing method;RNAfold， NetPhos 2.0， NetOGlyc 4.0， SOPMA and SWISS-MODEL and other online software were used for bioinformatics analysis after estimating allele frequency of each SNP locus. Analyzing the effect of ASIP gene SNP site mutation in different feather color chickens on gene mRNA secondary structure， ASIP protein post-translational modification site and its secondary and tertiary structure. 【Result】Seven SNPs were detected in ASIP gene from six chicken breeds， they were Exon-2-G17C， Exon-2-T168C， Exon-2-C3032T， Exon-2-T3203G， Exon-2-G3287A， Exon-2-G3313T and Exon-2-C3350T， respectively. Exon-2-T3203G only appeared in Roman layers， and Exon-2-G3287A only appeared in Yaoshan chicken. Exon-2-T168C only appeared in Guizhou yellow chicken and Xingyi bantam white feather line which was located in the coding region of ASIP gene. The mutation led to the change of coding amino acid site[threonine（Thr）→methionine（Met）]， which caused the change of secondary structure of ASIP gene mRNA， increased minimum free energy and decreased stability. Exon-2-T168C site mutation also caused the change of number and location of ASIP protein kinase phosphorylation sites， but the glycosylation sites did not change. The secondary structure of ASIP protein such as the proportions of α-helix， β-turn， and extended chains increased， while the proportion of random coils decreased after Exon-2-T168C site mutated.The prediction result of the protein tertiary structure was consistent with the result of secondary structure. 【Conclusion】Exon-2-T168C locus is detected in the ASIP gene of Guizhou yellow chicken and Xingyi bantam white feather line. Exon-2-T168C locus causes the change of mRNA secondary structure， number of protein kinase phosphorylation sites and positions， and changes the secondary and tertiary structure of ASIP protein.But it is not the internal mechanism that affects the feather color diffe-rence between Guizhou yellow chicken and Xingyi bantam white feather line.

Key words： chicken; feather color; agouti signal protein（ASIP） gene; SNP locus; bioinformatics

Foundation item： Guizhou Science and Technology Planning Project（QKHZC〔2019〕2285）

0 引言

【研究意義】羽色作為家禽重要的經(jīng)濟(jì)性狀，可用于家禽品種品系劃分及新品種選育。此外，羽色作為重要的遺傳標(biāo)記，不僅可用于家禽品種純度評(píng)價(jià)，還可利用伴性遺傳的羽色基因進(jìn)行自別雌雄配套系生產(chǎn)（張健，2019）。目前，針對(duì)畜禽毛色或羽色的遺傳機(jī)制研究主要集中在哺乳動(dòng)物（敖秋桅等，2015;李英杰等，2015;李隱俠等，2020），包括豬、牛、羊和小鼠等;有關(guān)家禽羽色則多以同一品種不同羽色群體為研究對(duì)象，探究品種內(nèi)羽色差異形成機(jī)制，但針對(duì)不同家禽品種羽色差異的研究鮮見報(bào)道。因此，運(yùn)用分子生物學(xué)手段研究不同羽色差異顯著雞種的羽色形成機(jī)制，可為地方雞種的選育和生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】家禽羽色差異主要是由黑色素的種類不同及分布不均所致（鄧素華等，2003）。在哺乳動(dòng)物及禽類中，黑色素主要分為真黑色素和褐黑色素，而黑色素的合成受多個(gè)基因調(diào)控，包括黑色素皮質(zhì)素受體1基因（MC1R）、酪氨酸酶基因（TYR）、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）及刺豚鼠信號(hào)蛋白基因（ASIP）等（陳曉燕等，2012;李英杰等，2015）。其中，ASIP基因又稱鼠灰色基因（Agouti），由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，第1外顯子（Exon-1）為非編碼序列且位于ASIP基因5'端非編碼區(qū)（5'-UTR），而第2、3和4外顯子（Exon-2～Exon-4）位于編碼區(qū)（張靜等，2015）。已有研究表明，ASIP基因會(huì)抑制MC1R和MITF等基因的表達(dá)，促進(jìn)褐黑素產(chǎn)生，通過改變真黑色素和褐黑色素的比例而影響哺乳動(dòng)物毛色或禽類羽色（劉曉妮等，2015）。ASIP基因以競爭性抑制結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體及下調(diào)MC1R信號(hào)水平的方式，促使真黑色素合成轉(zhuǎn)變?yōu)楹趾谏睾铣桑▌⒘樟岬龋?011）。此外，ASIP基因通過降低環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平來拮抗MSH-MC1R作用信號(hào)而下調(diào)MITF基因表達(dá)（Hida et al.，2009），最終導(dǎo)致褐黑色素合成增加，致使畜禽的毛色由黑色變?yōu)辄S色或棕紅色。ASIP基因作為參與黑色素合成的重要基因，對(duì)家禽羽色的形成也具有重要作用。在哺乳動(dòng)物中，付冬麗等（2013）通過研究ASIP基因在野豬群體里的變異及其與被毛表型間的相關(guān)性，結(jié)果在3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，并推測(cè)不同毛色的野豬群體是由該突變位點(diǎn)C等位基因所引起;蘇詠梅等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，ASIP基因第3外顯子349位點(diǎn)突變可作為鑒別家驢中純黑色驢和非純黑色驢的早期選育分子標(biāo)記。在禽類上，徐瑩（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在朝鮮鵪鶉（栗羽）及其突變系黑羽和白羽群體中，ASIP基因在不同日齡淺色羽朝鮮鵪鶉中的表達(dá)量均高于深色羽朝鮮鵪鶉;張靜（2015）通過直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)鵝ASIP基因存在SNP位點(diǎn)和插入或缺失突變，且PCR-RFLP分型結(jié)果表明A等位基因在皖西白鵝白羽、皖西白鵝花羽、獅頭鵝灰羽和獅頭鵝白羽4個(gè)群體中均占優(yōu)勢(shì);彭思雪（2016）通過分析鴨ASIP基因多態(tài)性與羽色性狀的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因存在5個(gè)SNPs位點(diǎn)，且證實(shí)ASIP基因是鴨基因組上的多拷貝基因，但其拷貝數(shù)在不同羽色鴨群間差異不顯著，因而推測(cè)ASIP基因拷貝數(shù)與羽色變異不相關(guān);丁穎等（2018）研究表明，在灰羽和白羽2種羽色朗德鵝中，皮膚ASIP基因的表達(dá)量在1月齡無顯著差異，但至2月齡時(shí)白羽ASIP基因的表達(dá)量顯著高于灰羽?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，針對(duì)不同羽色差異顯著雞種ASIP基因SNP位點(diǎn)篩選及其生物信息學(xué)分析的研究鮮有報(bào)道，不同羽色雞種ASIP基因是否存在SNP位點(diǎn)差異及SNP位點(diǎn)差異是否導(dǎo)致編碼蛋白功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致不同雞種羽色差異的機(jī)制也尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】參考NCBI已公布的紅色原雞ASIP基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ASIP基因編碼區(qū)第2、3和4外顯子的特異性引物（由于雞ASIP基因第1外顯子位于非編碼區(qū)，因此未進(jìn)行檢測(cè)），利用DNA混合池結(jié)合PCR直接測(cè)序法對(duì)白羽、黑羽、黃羽和麻羽4種羽色差異顯著的羅曼蛋雞、泰和烏骨雞、興義矮腳雞白羽系、赤水烏骨雞、貴州黃雞和瑤山雞等6個(gè)雞種進(jìn)行ASIP基因SNP位點(diǎn)篩選，并開展生物信息學(xué)分析，為揭示ASIP基因SNP位點(diǎn)突變與不同雞種羽色差異形成機(jī)制的關(guān)聯(lián)性提供理論依據(jù)，進(jìn)而篩選出與雞種羽色相關(guān)的輔助育種分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

以6月齡的羅曼蛋雞、泰和烏骨雞、興義矮腳雞白羽系、赤水烏骨雞、貴州黃雞和瑤山雞為研究對(duì)象，各150羽，公母各半，所有試驗(yàn)雞均由貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)提供。其中，羅曼蛋雞為白羽;泰和烏骨雞為白羽絲毛;興義矮腳雞白羽系為白羽;赤水烏骨雞毛色為黑羽和雜色羽2種，其中母雞均為黑羽，公雞少部分帶有雜色羽;貴州黃雞為黃羽;瑤山雞為麻羽。為研究不同雞種羽色形成機(jī)制，按其羽色分為白羽、黑羽、黃羽和麻羽4個(gè)雞種。本研究選用的試驗(yàn)雞均為經(jīng)不同選育且具有顯著羽色差異雞種，其選育程度由高到低依次為羅曼蛋雞>瑤山雞>泰和烏骨雞>赤水烏骨雞>貴州黃雞>興義矮腳雞白羽系，擬從品種和選育程度2個(gè)方面對(duì)6個(gè)雞種羽色差異的形成機(jī)制進(jìn)行探究。采用含肝素鈉的采血管經(jīng)翅靜脈采血1.5 mL，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存用于后期基因組DNA提取。Ezup柱式動(dòng)物血液基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖、GoldView核酸染料、DM2000 DNA Marker和2×Taq Master Mix等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，雙蒸水和TBE電泳液由高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自備。主要儀器設(shè)備：C1000 TouchTM Thermal Cy-cler PCR儀（Bio-Rad公司）;凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）;DYCZ-24F電泳儀（北京六一儀器廠）;低溫高速冷凍離心機(jī)（無錫瑞江分析儀器有限公司）;超微量紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2. 4. 3 ASIP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 使用SOPMA預(yù)測(cè)雞ASIP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（表5和圖4）顯示，Exon-2-T168C位點(diǎn)突變導(dǎo)致ASIP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈的占比增加，而無規(guī)則卷曲占比降低。

2. 4. 4 ASIP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 利用SWISS-MODEL對(duì)雞ASIP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，Exon-2-T168C位點(diǎn)突變導(dǎo)致ASIP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（圖5）。

3 討論

地方雞品種因其肉質(zhì)鮮美在家禽市場(chǎng)上具有很大潛力，但其羽色參差不齊極大影響其商品經(jīng)濟(jì)效益。從家禽羽色育種中選育出羽色一致的地方雞品種，是破解地方雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸問題的有效措施，當(dāng)前常用的選育方法是不斷選留羽色一致的種群進(jìn)行自繁自養(yǎng)，以獲得羽色一致的品系，但此法耗時(shí)長、投入大且育種效果緩慢。運(yùn)用分子生物學(xué)手段篩選家禽羽色形成相關(guān)基因的分子標(biāo)記可提高育種進(jìn)程，并提高家禽羽色整齊度，有效縮短育種時(shí)間，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益。目前，關(guān)于ASIP基因SNP位點(diǎn)的研究主要集中在地方豬（師科榮，2003）、綿羊（付冬麗等，2014）、山羊（王壯志等，2014）、牦牛（張建一等，2014）及家兔（李維等，2016）等哺乳動(dòng)物被毛毛色表型上，而與家禽羽色相關(guān)的研究報(bào)道較少。Hiragaki等（2008）研究表明，日本鵪鶉黃色羽和隱性黑羽是由ASIP基因控制，隱性黑羽是由于ASIP基因缺失一段8 bp的序列（CTGTTAAA）所致。于文華（2012）研究發(fā)現(xiàn)，鴨ASIP基因缺失一段五堿基序列（AAGGT）能破壞基因第3外顯子與第3內(nèi)含子間的拼接供體位點(diǎn)，而引起ASIP基因外顯子跳躍，可能是家鴨暗褐色羽變異的主要原因。本研究以羅曼蛋雞、泰和烏骨雞、興義矮腳雞白羽系、赤水烏骨雞、貴州黃雞和瑤山雞等羽色差異顯著的地方雞品種為試驗(yàn)對(duì)象，通過DNA混合池及PCR直接測(cè)序法，對(duì)不同羽色雞種ASIP基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選，共檢測(cè)到7個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T。其中，Exon-2-T3203G只出現(xiàn)在羅曼蛋雞上，Exon-2-G3287A只出現(xiàn)在瑤山雞上。此外，除Exon-2-T168C位點(diǎn)位于編碼區(qū)外，其余SNP位點(diǎn)均位于非編碼區(qū)，與ASIP基因編碼區(qū)序列在禽類中具有高度保守性（梁正翠等，2011）的研究結(jié)果一致。赤水烏骨雞、泰和烏骨雞、羅曼蛋雞和瑤山雞均是經(jīng)過世代選育羽色遺傳較穩(wěn)定的品種，而貴州黃雞是以金黃夏洛克雞為父本、快大型肉雞為母本通過級(jí)進(jìn)雜交培育獲得;興義矮腳雞羽色為黃羽，其白羽系是經(jīng)過選育的隱性突變純合系。在本研究中，6個(gè)雞種的羽色均能在其后代中穩(wěn)定遺傳，且不會(huì)發(fā)生羽色改變，說明顯著差異羽色的形成機(jī)制可能與ASIP基因多態(tài)性無關(guān)。

羽色形成受黑色素的影響，而黑色素合成是一個(gè)由多基因調(diào)控的復(fù)雜生化過程。不同禽類羽色差異與其黑色素合成相關(guān)基因在皮膚及毛囊組織中的差異表達(dá)密切相關(guān)（徐瑩，2014;陳黎等，2015;丁穎等，2018）。本研究結(jié)果表明，雖然在貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系A(chǔ)SIP基因第2外顯子檢測(cè)到1個(gè)SNP位點(diǎn)（Exon-2-T168C），且該位點(diǎn)突變導(dǎo)致的基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)改變?cè)谫F州黃雞和興義矮腳雞白羽系間無明顯差異，但兩者的羽色存在顯著差異，即Exon-2-T168C位點(diǎn)無法解釋其羽色差異。由于本研究選用的6個(gè)雞種羽色差異與Exon-2-T168C位點(diǎn)均無關(guān)，因此下一步需檢測(cè)ASIP基因與相關(guān)黑色素合成基因在不同羽色雞種皮膚及毛囊等組織中的表達(dá)情況，進(jìn)而探究ASIP基因的差異表達(dá)是否與不同雞種的羽色差異相符。此外，Exon-2-T168C位點(diǎn)突變能引起ASIP基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，使其穩(wěn)定性降低;且該突變屬于錯(cuò)義突變，致使編碼的Thr突變?yōu)镸et，導(dǎo)致ASIP基因編碼蛋白的磷酸化激酶位點(diǎn)數(shù)量和位置均發(fā)生改變，引起ASIP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Rieder等（2001）研究表明ASIP基因第2外顯子上11 bp的缺失與馬的隱性黑毛相關(guān)。何曉丹等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，染色體工程小鼠ASIP基因編碼區(qū)存在的5個(gè)SNPs位點(diǎn)能致使其編碼蛋白產(chǎn)生3個(gè)錯(cuò)義突變，進(jìn)而丟失1個(gè)β-折疊且蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致小鼠的毛色由淺灰色變?yōu)樯罨疑?。本研究中，Exon-2-T168C位點(diǎn)突變導(dǎo)致貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系A(chǔ)SIP基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白磷酸激酶位點(diǎn)數(shù)量和位置及ASIP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，但兩者的羽色存在顯著差異，因此推測(cè)Exon-2-T168C位點(diǎn)突變并不是影響貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系羽色差異的原因。Exon-2-T168C突變位點(diǎn)是否導(dǎo)致ASIP基因編碼蛋白的功能改變尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系A(chǔ)SIP基因上檢測(cè)到Exon-2-T168C位點(diǎn)，且該位點(diǎn)突變能引起ASIP基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白磷酸激酶位點(diǎn)數(shù)量和位置及ASIP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，但并不是影響貴州黃雞和興義矮腳雞白羽系羽色差異的內(nèi)在機(jī)制。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-01-13

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐〔2019〕2285號(hào)）

作者簡介：*為通訊作者，張福平（1978-），博士，副教授，主要從事家禽育種研究工作，E-mail：zfu-1010@126.com。簡華鋒（1997-），研究方向?yàn)樘胤N畜禽飼養(yǎng)，E-mail：jianhuafeng@zju.edu.cn