國 田,夏曉雨,張 娜,柴洋洋,郭慶啟,3
(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076;3.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040;)
藍(lán)莓為杜鵑花科Ericaceae 越橘屬Vaccinium植物,是新興的木本小漿果類保健果樹,主要分布在我國的長白山及大小興安嶺林區(qū)。藍(lán)莓含有豐富的營養(yǎng)成分,具有良好的營養(yǎng)保健功能和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景[1],除維生素A、維生素C、果糖和膳食纖維外,更富含原花青素、花青素、鞣花酸、葉酸等酚類物質(zhì),使藍(lán)莓具有多種生理活性功能,如抗氧化、提高免疫力以及改善夜視等功效,被認(rèn)為是膳食結(jié)構(gòu)中抗氧化劑的最佳來源之一,也是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的新興小漿果樹種[2-3]。野生藍(lán)莓因其口感較酸而不宜鮮食,且不耐運(yùn)輸和貯存,因此常被制成各種易于貯存的加工品,如果汁、果酒、藍(lán)莓果醬等產(chǎn)品,以及高級(jí)化妝品和醫(yī)療保健品的原材料[4]。隨著消費(fèi)者對(duì)食品功能性和營養(yǎng)性關(guān)注度的提升,藍(lán)莓及其加工品作為極具保健價(jià)值的功能性食品而備受關(guān)注。
藍(lán)莓酒是一種以藍(lán)莓為主要原料,經(jīng)酵母發(fā)酵、釀造而成的深加工產(chǎn)品,富含酚類化合物、醇酯、原花青素等多種功能性因子[5]。因其具有獨(dú)特的醇和口感、較高的營養(yǎng)價(jià)值和抗氧化能力而備受科研人員的關(guān)注和消費(fèi)者的喜愛。標(biāo)準(zhǔn)的藍(lán)莓酒色澤應(yīng)呈現(xiàn)寶石紅色,酒體清亮無渾濁,藍(lán)莓酒的香氣應(yīng)既具有天然藍(lán)莓果香,也含有發(fā)酵而來的濃厚醇香。藍(lán)莓酒的香氣和口感決定了產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)和風(fēng)格,是衡量藍(lán)莓酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(SPMEGC-MS)聯(lián)用技術(shù)是研究食品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)常用的有效手段。GC-MS 技術(shù)具有檢測靈敏度高、操作快速、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn),而且有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫可供檢索,是定性和定量的優(yōu)良手段。目前,國內(nèi)外關(guān)于藍(lán)莓酒的研究大多集中在藍(lán)莓酒釀造工藝、藍(lán)莓酒營養(yǎng)及抗氧化功能、藍(lán)莓酒營養(yǎng)成分提取及穩(wěn)定性研究等方面[6-8]。關(guān)于藍(lán)莓酒香氣成分方面的研究也主要集中在不同酵母、不同品種和發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面[9-11],對(duì)藍(lán)莓酒香氣物質(zhì)的研究較少,尤其是不同發(fā)酵方式對(duì)藍(lán)莓酒香氣影響的研究鮮見報(bào)道。在發(fā)酵果酒的釀造過程中,浸漬工藝主要決定了原料漿果中的香氣和酚類物質(zhì)進(jìn)入酒體中的含量,浸漬的關(guān)鍵在于選擇浸出花青素和優(yōu)質(zhì)單寧,而不浸出或少浸出帶有苦味和生青味的劣質(zhì)單寧,因此出現(xiàn)了不同溫度形式的浸漬方式。對(duì)比傳統(tǒng)的帶渣發(fā)酵工藝,發(fā)酵前期的冷浸漬有利于提高果香濃郁度,熱處理則有利于提高產(chǎn)品的口感結(jié)構(gòu),達(dá)到改善果酒風(fēng)味的目的[12]。因此本研究選用低溫預(yù)浸漬發(fā)酵、熱浸漬和帶渣發(fā)酵3 種常見的藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝技術(shù),對(duì)不同發(fā)酵方式所制得的藍(lán)莓酒采用固相微萃取和氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析測定發(fā)酵前后的香氣物質(zhì)成分和含量,比較不同發(fā)酵方式對(duì)藍(lán)莓酒發(fā)酵香氣的影響,分析各香氣成分對(duì)果酒香型特征風(fēng)格的影響,為藍(lán)莓酒發(fā)酵方式的選擇及加工提供數(shù)據(jù)參考。
1.1.1 主要原料與試劑
野生藍(lán)莓Vaccinium uliginosum凍果購自大興安嶺超越野生漿果開發(fā)有限公司,-18℃凍藏;果膠酶:食品級(jí),酶活力50 000 U·g-1,和氏璧生物科技有限公司;高活性干葡萄酒酵母:湖北安琪酵母股份有限公司;所用化學(xué)試劑均為分析純。
1.1.2 儀器設(shè)備
EL20 梅特勒-托利多pH 計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;JYZ-C500 九陽榨汁機(jī),九陽股份有限公司;GZX 型恒溫培養(yǎng)箱,金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠;6890-MS 5973N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,安捷倫科技(中國)有限公司;頂空固相微萃取裝置,手動(dòng)進(jìn)樣手柄,50/30 μmDVB/CAR/PDMS 萃取纖維,美國Supleco 公司。
1.2.1 不同發(fā)酵方式的藍(lán)莓酒的制作
酶解:果膠酶用量0.25%,50 ℃,2 h。
成分調(diào)整:白砂糖調(diào)整糖度至20° Birx,CaCO3等調(diào)節(jié)酸度至3.4,K2S2O5添加量0.01 g/L。
1.2.2 香氣成分分析檢測方法
采用HS-SPME-GC-MS 對(duì)3 種工藝所制得的藍(lán)莓酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測[13]。
頂空固相微萃取條件:取約20.0 mL 樣品加入40 mL 樣品瓶中,將樣品瓶放入60 ℃的水浴中平衡10 min,將老化好(老化時(shí)間:5 min)的萃取針頭插入樣品瓶中,將石英纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中,恒溫60 ℃萃取30 min,用手柄將纖維頭推回針頭內(nèi)拔出,插入GC-MS 的進(jìn)樣器于250 ℃條件下解析1 min,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。
色譜條件:進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣He,流速1.0 mL/min。采用程序升溫方式,由室溫升至80 ℃保持2 min,然后以6 ℃/min 升至230 ℃,在此溫度下保持13 min。
質(zhì)譜條件:MS 離子源在225 ℃全掃描,電離方式EI,電子能量70 eV,掃描質(zhì)量范圍 50~500 amu。
對(duì)低溫預(yù)浸漬、熱浸漬和帶渣3 種發(fā)酵方式制備的藍(lán)莓酒進(jìn)行揮發(fā)性成分測定,結(jié)果如表1~3所示。
由表1~4 可知,無論采用哪種發(fā)酵方式,藍(lán)莓果汁經(jīng)發(fā)酵所制得的藍(lán)莓酒中香氣物質(zhì)的種類都要高于發(fā)酵之前的藍(lán)莓果汁;且經(jīng)過發(fā)酵之后,酒中酯類和酸類物質(zhì)種類都有了明顯的增加。曹雪丹等[14]在對(duì)比了藍(lán)莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分變化后發(fā)現(xiàn),藍(lán)莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的種類和構(gòu)成變化較大,由36 種增加到46 種。
3 種發(fā)酵方式中高溫預(yù)浸漬發(fā)酵后酒中主要香氣物質(zhì)的種類最多,為39 種,高于低溫預(yù)浸漬發(fā)酵的36 種和帶渣發(fā)酵的31 種,推測發(fā)酵前70 ℃溫度的預(yù)處理更有利于發(fā)酵體系中微生物和酶的作用,在發(fā)酵過程中代謝和產(chǎn)生了更多的香氣類物質(zhì)。王菁等[15]在不同制作工藝對(duì)歐李果酒品質(zhì)比較中,在熟汁發(fā)酵酒中測出35 種揮發(fā)性成分,醇類和羧酸類化合物減少,但酯類化合物大大升高,可能是因?yàn)闊崽幚砑铀倭缩セ磻?yīng)的進(jìn)行。
由表5可知,3 種工藝發(fā)酵前的藍(lán)莓果汁中香氣物質(zhì)含量分別為67.28%、56.71%和55.40%,而經(jīng)過低溫預(yù)浸漬、熱浸漬和帶渣發(fā)酵工藝制備藍(lán)莓酒后,香氣物質(zhì)含量分別為94.02%、91.58%和83.52%,香氣物質(zhì)含量都有了明顯的提升,這其中以熱浸漬發(fā)酵工藝方式提升最為顯著。陳娟等[16]在研究3 種獼猴桃酒在發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣成分的變化中對(duì)比了原汁和發(fā)酵5、12 和19 d獼猴桃酒的香氣成分,發(fā)酵后的獼猴桃酒中的香氣種類和成分都要高于原汁。姜永超等[17]在不同釀酒酵母對(duì)菠蘿果汁發(fā)酵特性的比較中,對(duì)菠蘿果汁以及不同酵母發(fā)酵的菠蘿果酒進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的檢測,果汁中共鑒定出15 種化合物香氣物質(zhì),共占揮發(fā)性成分的29.66%;果汁經(jīng)過發(fā)酵后各類揮發(fā)性成分所占比重發(fā)生較大的變化,香氣物質(zhì)的組成和含量均有明顯增加。不同酵母發(fā)酵的果酒中香氣物質(zhì)種類有22~27 種,含量占其揮發(fā)性成分的76.24%~90.88%。酵母代謝是產(chǎn)生果酒香氣的途徑之一。這些研究表明,在酵母菌的發(fā)酵作用下,發(fā)酵原汁中的風(fēng)味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了各種豐富的揮發(fā)性香氣成分,使果酒比果汁擁有更豐富的香氣物質(zhì)。
表1 低溫預(yù)浸漬發(fā)酵方式所得藍(lán)莓酒中的主要揮發(fā)性成分Table 1 Major volatile components of blueberry wine by low temperature pre-impregnated fermentation mode
表2 熱浸漬發(fā)酵方式所得藍(lán)莓酒中的主要揮發(fā)性成分Table 2 Major volatile components of blueberry wine by hot impregnated fermentation mode
表3 帶渣發(fā)酵方式所得藍(lán)莓酒中的主要揮發(fā)性成分Table 3 Major volatile components of blueberry wine by slag fermentation mode
續(xù)表3Continuation of table 3
表4 3 種釀造方式藍(lán)莓酒發(fā)酵前后主要香氣成分統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of main aroma components of blueberry wine by three brewing modes
表5 3 種釀造方法藍(lán)莓酒發(fā)酵前后主要香氣含量Table 5 Main aroma content of blueberry wine before and after fermentation with three brewing modes %
3.1.1 醇類物質(zhì)的比較分析
醇類化合物是酵母通過糖分解代謝或脫羧反應(yīng)和氨基酸的脫氨基作用形成的代謝產(chǎn)物[18],適宜濃度可襯托酯香,促進(jìn)香氣的協(xié)調(diào)性,是果酒中重要的香氣物質(zhì)。3 種釀造方式發(fā)酵前后共檢測出9 種醇類物質(zhì),發(fā)酵前共有的醇類物質(zhì)有3 種,分別是乙醇、苯乙醇和4-萜烯醇。帶渣發(fā)酵后所含醇類化合物種類最多,有7 種,低溫預(yù)浸漬發(fā)酵前后共檢測出醇類物質(zhì)4 種,而熱浸漬最少,為3 種。帶渣發(fā)酵酒醇類含量最高(36.69%),其次是低溫預(yù)浸漬發(fā)酵酒(19.64%),熱浸漬發(fā)酵酒最低(14.39%)。3 種發(fā)酵工藝都促進(jìn)了苯乙醇含量的增加,尤其以低溫預(yù)浸漬和帶渣發(fā)酵2種工藝增加更為顯著。
苯乙醇是藍(lán)莓酒重要的呈香物質(zhì)之一,具有花香味呈清淡的玫瑰香氣,它主要存在于茉莉等植物的精油中,在低濃度下也可以產(chǎn)生很濃烈的玫瑰香味,所以低溫預(yù)浸漬發(fā)酵更賦予了藍(lán)莓酒較濃郁的花香風(fēng)味[19]。帶渣發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)較多,其中3-甲基-1-丁醇、1-己醇具有植物香氣,正戊醇略帶果香,而異丁醇具有酒精味、指甲油的香味[20],可能是由于果渣中底物種類的多樣性,在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的醇類物質(zhì)。
3.1.2 酯類物質(zhì)的比較分析
酯類主要來源于果實(shí)和酒精發(fā)酵,具有水果香氣,是對(duì)酒香氣有很大影響的一類呈發(fā)酵香化合物[21]。酯類化合物相對(duì)含量在整體揮發(fā)性物質(zhì)中的比例最大,是構(gòu)成果酒香氣的重要物質(zhì),對(duì)果酒的主體香型及風(fēng)格具有重要的影響[22]。3 種釀造方式發(fā)酵前后共檢出酯類34 種,共有的5 種酯類分別為己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和棕櫚酸乙酯。
低溫預(yù)浸漬和熱浸漬發(fā)酵前后酯類化合物種類基本相同,帶渣發(fā)酵前后酯類化合物種類與其他兩種差異較大。低溫預(yù)浸漬和熱浸漬發(fā)酵前后分別檢出21 種和24 種酯類化合物且含量最高的均為癸酸乙酯,分別為20.39%和16.55%;帶渣發(fā)酵前后檢出酯類物質(zhì)14 種,含量最高為辛酸乙酯9.15%,低溫預(yù)浸漬和熱浸漬發(fā)酵后的酯類物質(zhì)種類要多于帶渣發(fā)酵。乙酸乙酯具有果香味,是藍(lán)莓果酒香氣的重要構(gòu)成成分,可以協(xié)調(diào)苦澀味,令酒香醇厚,是反映果酒風(fēng)味優(yōu)劣的重要物質(zhì)。低溫預(yù)浸漬和熱浸漬中的月桂酸乙酯有甜橙和葡萄的香味;癸酸乙酯具有葡萄香氣,低溫預(yù)浸漬發(fā)酵酒中癸酸乙酯含量最高,而辛酸乙酯具有白蘭地酒香味,都是柔和、愉快而持久的香氣成分,具有玫瑰花香、橙子果香。
袁曉紅等[23]對(duì)低溫預(yù)浸漬發(fā)酵的藍(lán)莓酒進(jìn)行香氣成分分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯和癸酸乙酯經(jīng)16℃預(yù)發(fā)酵后含量明顯高于25℃發(fā)酵,說明16℃發(fā)酵更適合藍(lán)莓酒風(fēng)味酯類物質(zhì)的富集。Molina等[24]對(duì)葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行溫度對(duì)其影響的研究時(shí)發(fā)現(xiàn),乙酸乙酯在低溫條件下的含量是高溫條件下的4 倍,辛酸乙酯在低溫條件下的含量是高溫條件下的3.5~4.0 倍。乙酸異戊酯具有似香蕉味、梨的酸甜味[25],甲酸異戊酯有特殊的香蕉和李子的香甜氣[26],丁酸乙酯具有強(qiáng)烈的似菠蘿、香蕉的甜果香氣,發(fā)酵后3 種工藝中熱浸漬發(fā)酵工藝棕櫚酸乙酯的含量最高,呈微弱奶油香氣,棕櫚酸甲酯呈微弱蠟香和奶油香氣,亞油酸乙酯具有降低血液中膽固醇和血脂的作用。
3.1.3 酸類物質(zhì)的比較分析
脂肪酸類物質(zhì)在濃度較低時(shí)呈奶油和奶酪香,濃度太高則會(huì)產(chǎn)生酸澀味和腐臭味[27],其可與醇類物質(zhì)發(fā)生發(fā)應(yīng),形成酯類,使酒體香氣更加協(xié)調(diào)、平衡[28]。低溫預(yù)浸漬和熱浸漬發(fā)酵后均檢出5 種酸類物質(zhì),帶渣發(fā)酵檢出4 種酸類物質(zhì)。3 種發(fā)酵方式共有的酸類物質(zhì)有2 種,分別為辛酸和癸酸;此外,在低溫預(yù)浸漬和熱浸漬發(fā)酵后癸酸含量最高,癸酸具有愉快的脂肪氣味,辛酸作為關(guān)鍵揮發(fā)性香氣,在低濃度時(shí)散出類似奶酪和奶油的風(fēng)味[29]。低溫預(yù)浸漬和熱浸漬中的月桂酸使得酒體具有堅(jiān)果和月桂油香氣[30]。
3.1.4 其他物質(zhì)的比較分析
低溫預(yù)浸漬和熱浸漬發(fā)酵前后都不含有醛類化合物,只有帶渣發(fā)酵前后含有。有研究表明,醛類物質(zhì)在果酒釀造過程中逐漸發(fā)生轉(zhuǎn)化[31],主要是發(fā)酵過程中,醛類物質(zhì)十分不穩(wěn)定,進(jìn)一步氧化酯化形成了更加穩(wěn)定的其他物質(zhì)[32]。醛酮類物質(zhì)常具有特殊的香氣,同時(shí)能使酒體香氣趨于融合。帶渣發(fā)酵含有的苯乙酮具有水果香氣,癸醛呈新鮮的油脂香,2-壬酮呈水果、花、油脂、蕓香和藥草香氣。萜烯類廣泛存在于漿果中,果實(shí)中的糖苷結(jié)合態(tài)萜類可以在酶解或酸解的作用下形成游離態(tài)的萜類芳香成分,從而增強(qiáng)果酒的風(fēng)味[13]。這些萜烯類組分雖然相對(duì)含量低,但其香氣值很高,是藍(lán)莓酒形成濃郁香氣中不可忽視的因素,其中D-檸檬烯具有似橙香氣。
3 種釀造方式中,低溫預(yù)浸漬和熱浸漬在揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量上差異較小,共有的揮發(fā)性物質(zhì)很多,且3 種釀造方式藍(lán)莓酒發(fā)酵后的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量均高于發(fā)酵前,發(fā)酵后的雜環(huán)類化合物減少,產(chǎn)生多種醇類和酯類化合物。黃婷等[33]運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用鑒定出藍(lán)莓酒中的54 種香氣物質(zhì),主要的醇類物質(zhì)為2,3-丁二醇和異戊醇。曹雪丹等[14]測定藍(lán)莓酒主發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分時(shí)發(fā)現(xiàn),完成藍(lán)莓酒由果汁到果酒的主要香氣變化的階段是主發(fā)酵,主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的種類由36 種增至46 種。低溫預(yù)浸漬發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)含量最高,醇類和酯類總含量最高80.24%,且苯乙醇、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯這4 種特征性香氣物質(zhì)在低溫預(yù)浸漬發(fā)酵后相對(duì)含量最高達(dá)到32.35%。說明低溫預(yù)浸漬發(fā)酵方式賦予藍(lán)莓酒更濃郁的香氣。熱浸漬發(fā)酵后的香氣種類最多,酯類香氣物質(zhì)最多達(dá)到24 種,相對(duì)含量最高為63.07%,但是醇類和酯類揮發(fā)性物質(zhì)總相對(duì)含量比低溫預(yù)浸漬低。帶渣發(fā)酵與其他兩種釀造方式的揮發(fā)性物質(zhì)種類差異很大,只有帶渣發(fā)酵后含有醛類、酮類和萜烯類。這體現(xiàn)出果皮、果肉在果酒香氣形成中的某些作用,在發(fā)酵后使果渣中的香氣成分充分浸漬出來豐富果香和酒香,但是帶渣發(fā)酵后的香氣種類和含量都是3 種發(fā)酵方式中最少的[34]。因此,對(duì)比3 種發(fā)酵方式的香氣物質(zhì)種類、相對(duì)含量以及特征性香氣含量等方面,以低溫預(yù)浸漬發(fā)酵所制得的藍(lán)莓酒的風(fēng)味品質(zhì)為最佳。
SPME 對(duì)發(fā)酵藍(lán)莓酒中主要揮發(fā)性物質(zhì)能夠很好地吸附,與傳統(tǒng)的香氣成分含量測定的方法相比具有快速、靈敏、不需要溶劑等優(yōu)點(diǎn)。將SPME與GC-MS 聯(lián)用能夠較好地分析藍(lán)莓酒中揮發(fā)性的風(fēng)味物質(zhì),測定結(jié)果表明發(fā)酵藍(lán)莓酒具有較豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成,香氣物質(zhì)種類由高到低依次為酯類>烷類>醇類>酸類>苯環(huán)類,總含量從高到低依次為酯類>醇類>酸類>烷類>苯環(huán)類;特征性的香氣物質(zhì)主要有苯乙醇、乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸、癸酸、2-壬酮、D-檸檬烯等。對(duì)比3 種發(fā)酵方式,低溫預(yù)浸漬發(fā)酵的藍(lán)莓酒揮發(fā)性物質(zhì)、醇類和酯類以及特征性香氣物質(zhì)的相對(duì)含量最高,低溫預(yù)浸漬發(fā)酵的藍(lán)莓酒風(fēng)味品質(zhì)最佳。研究結(jié)果表明利用GC-MS 結(jié)合SPME 技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵工藝藍(lán)莓酒香氣特征進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和分析,可以為藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝的選擇及其香氣品質(zhì)的分析、調(diào)控和提升提供理論依據(jù)。
藍(lán)莓酒的香氣物質(zhì)不僅受發(fā)酵條件的影響,還與原料的品種和產(chǎn)地的環(huán)境因素等條件有關(guān),同時(shí)由于中國傳統(tǒng)的酒文化,使得人們?cè)陲嬘冒l(fā)酵酒的時(shí)候,不僅能帶來口感上的享受,還能帶來舒爽愜意的感覺,而這些感官評(píng)價(jià)只能通過專業(yè)人員的品嘗來鑒定,無論多么先進(jìn)的儀器都不能取代感官評(píng)價(jià)分析,因此后續(xù)要進(jìn)一步分析不同品種、產(chǎn)地和發(fā)酵年份之間的藍(lán)莓酒香氣物質(zhì)以及建立產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)和指紋圖譜,研究藍(lán)莓酒香氣特征形成的機(jī)制。