張志坤,蒲曉輝 ,袁 琦

河南大學(xué) 藥物研究所,河南 開封 475004

喜樹堿(camptothecin,CPT)主要是從植物喜樹中提取并分離出來的,是具備較強(qiáng)生物學(xué)活性的生物堿。羥基喜樹堿(hydroxycamptothecin,HCTP) 作為喜樹堿(CPT)的類似物,是從喜樹中提取出來的,并且有更強(qiáng)的抗腫瘤效果[1],對肝癌、胃癌、直腸癌、宮頸癌等均有比較好的效果[2-3]。槲皮素(quercetin,QUR)是一種天然黃酮[4],具有抗炎、抗氧化、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)和抗癌[5-8]等藥理作用。相關(guān)研究[9]表明,槲皮素具有良好的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用,主要是可以降低多藥耐藥相關(guān)蛋白過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對腫瘤藥物的外排作用。

目前,使用單一藥物治療癌癥經(jīng)常會產(chǎn)生耐藥性,影響其治療效果。聯(lián)合用藥可以在一定程度上緩解腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的問題。羥基喜樹堿具有良好的抗腫瘤活性,但同時也有較強(qiáng)的毒副作用。因此,羥基喜樹堿常常采用聯(lián)合用藥的方式用于抗腫瘤治療。如羥基喜樹堿與鉑類化合物[10]、抗代謝類抗腫瘤藥、其他抗腫瘤藥物等多種藥物聯(lián)合用藥。本實(shí)驗(yàn)在前期制劑研究中,選用了羥基喜樹堿和槲皮素作為模型藥物,聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤的治療。并同時建立測定納米混懸劑中羥基喜樹堿和槲皮素的含量測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羥基喜樹堿原料藥99%(湖北黃石飛云制藥);槲皮素原料藥98%(南京景竹生物科技有限公司);色譜甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司);W2695型高效液相色譜儀(北京京科瑞達(dá)科技有限公司);UV-2600日本島津公司紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);0.45 μm 無菌濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

分別稱取10 mg羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品及空白納米混懸劑,用甲醇進(jìn)行溶解,在25 mL 棕色容量瓶中定容后作為供試品。取約2 mL的甲醇溶液作為空白對照,在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,確定最佳檢測波長。結(jié)果見圖1。

由圖1 所示,羥基喜樹堿在222、266、384 nm處吸光度最大,而槲皮素有兩個最大吸收,分別在255 nm 和374 nm 處。并且可以觀察到羥基喜樹堿和槲皮素在374 nm 附近均有較強(qiáng)吸收,且在374 nm 波長處可以有效避免末端吸收和空白材料的干擾。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇374 nm 處作為藥物的檢測波長。

圖1 紫外波長掃描圖

2.2 色譜條件

色譜柱:Sino Chrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(60∶40);檢測波長374 nm,柱溫30 ℃;流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量20 μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別從濃度為25.3 μg·mL-1的羥基喜樹堿和25.5 μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液中精密量取10 mL轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中,使用色譜甲醇進(jìn)行定容并搖勻,得到濃度為10.12 μg·mL-1的羥基喜樹堿和10.2 μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液。精密量取羥基喜樹堿儲備液,加色譜甲醇稀釋為0.506、1.012、2.024、3.036、4.048、5.06、7.59、10.12 μg·mL-1的羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取槲皮素儲備液,加甲醇稀釋為0.51、1.02、2.04、3.06、4.08、5.1、7.65、10.2 μg·mL-1的 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照2.2色譜條件進(jìn)樣,測定。以藥物濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制線性回歸方程。羥基喜樹堿的線性回歸方程為:Y=81 268X-10 761(R2=0.999 9),線性范圍為0.506～10.12 μg·mL-1;槲皮素的線性回歸方程為:Y=67 343X-8 960.3(R2=0.999 9),線性范圍為0.51～10.2 μg·mL-1。由R值可知,羥基喜樹堿和槲皮素在線性范圍內(nèi),色譜峰面積與藥物濃度均有很好的線性關(guān)系。

2.4 專屬性考察

分別對空白溶劑、羥基喜樹堿及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品按照2.2色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣。

在實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件下,羥基喜樹堿A 保留時間t=6.985 min,槲皮素保留時間t=8.879 min,在374 nm 波長處兩者峰型較好,并且羥基喜樹堿和槲皮素可以很好的分離?？瞻兹軇αu基喜樹堿以及槲皮素的測定無干擾?？梢哉f明該方法專屬性良好,能夠滿足分析方法的要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取10.12 μg·mL-1羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,和10.2 μg·mL-1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份。當(dāng)天進(jìn)行測定,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其濃度的RSD 值,考察日內(nèi)精密度;隔天再次對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其濃度的RSD 值,考察日間精密度。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。日內(nèi)和日間精密度得RSD值均小于1.16%,說明該方法具有良好的精密度,能夠滿足樣品分析學(xué)的要求。

表1 日內(nèi)與日間精密度的結(jié)果(n=6)

2.6 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)主要從方法回收率和加樣回收率兩個方面進(jìn)行考察。分別取高、中、低3個不同濃度的羥基喜樹堿和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,根據(jù)2.2色譜條件進(jìn)樣測定,考察其方法回收率。精密稱取空白材料適量,然后按照制劑含量的80%、100%、120%,分別加入適量羥基喜樹堿和槲皮素原料藥,用甲醇稀釋定容并搖勻,進(jìn)樣測定,考察加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度方法回收率測定結(jié)果(n=3)

由表2可知,羥基喜樹堿和槲皮素在低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液方法回收率均在98.63%～100.54%之間,RSD 值小于0.32%,表明該方法回收率較好。加樣回收率進(jìn)行考察,結(jié)果見表3及表4。其回收率在98.59%～101.89%之間,RSD 值均小于1.73%,說明該方法加樣回收率較好。

表3 羥基喜樹堿加樣回收率結(jié)果(n=3)

表4 槲皮素加樣回收率結(jié)果(n=3)

3 討論

在抗腫瘤治療中,為了緩解耐藥性的問題,聯(lián)合用藥成為當(dāng)下的熱點(diǎn)。一方面可以緩解藥物的耐藥性,另一方面可以在降低毒副作用的同時提高藥物的治療效果。但是,聯(lián)合用藥樣品的含量測定需要同時兼顧兩種藥品。而建立一種方便、簡單、準(zhǔn)確度較高的測定方法,可以更好地推進(jìn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

本研究以羥基喜樹堿和槲皮素作為模型藥物,制備成納米混懸劑,使其用于抗腫瘤的治療。采用高效液相色譜法建立納米混懸劑中羥基喜樹堿和槲皮素的含量測定方法。對色譜條件進(jìn)行選擇,羥基喜樹堿是一類色氨酸-萜稀類生物堿,色譜法容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,最終確定流動相使用甲醇-水(60∶40)的比例時,可以較好地改善拖尾現(xiàn)象。

在線性范圍內(nèi)建立的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的線性關(guān)系,對其方法專屬性、精密度、回收率進(jìn)行考察,結(jié)果表明,建立的含量測定方法較簡便、專屬性較好、可靠、準(zhǔn)確度較高,可以用作納米混懸劑中羥基喜樹堿和槲皮素的含量測定。