基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討《時(shí)病論》春溫首方治療流行性感冒的作用機(jī)制

劉 毅,賈躍進(jìn)

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 太原030024;2.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山西 太原030024)

流行性感冒(簡稱流感)是一種因流感病毒引起并由空氣傳播的急性呼吸系統(tǒng)疾病,具有高度傳染性[1]。在20世紀(jì)曾發(fā)生3次流感大流行,造成大量人口死亡,目前每年仍呈季節(jié)性流行[2],威脅著全球人類健康安全[3]。研究認(rèn)為,早期的抗病毒治療是治療流感的有效方法[4],而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)仍缺乏相關(guān)的有效抗病毒藥物[5],因此挖掘中醫(yī)藥療法可為流感的治療提供一定的思路?！稌r(shí)病論》是清·雷豐所著的溫病學(xué)著作,本文所選用方劑為春溫首方,該方由防風(fēng)、桔梗、陳皮、苦杏仁、淡豆豉、蔥白組成,功效為辛溫解表,可解寒傷于表,內(nèi)有伏氣?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為,該方各組分有抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、抗肺損傷等作用[6-11]?！读餍行愿忻霸\斷與治療指南》中認(rèn)為輕癥中風(fēng)寒束表為其重要證型[12],故用辛溫解表的春溫首方對癥治療。中藥治療具有整體性、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),體現(xiàn)了其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)特質(zhì),因此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可為研究復(fù)雜中藥體系提供新思路[13]。本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析《時(shí)病論》春溫首方治療流感的可行性與作用機(jī)制,以期為臨床治療提供參考。

1 方法

1.1 藥物活性成分與靶點(diǎn)搜集 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以春溫首方各藥物為關(guān)鍵詞檢索,并限定OB(oral bioavailability)≥30%,DL(drug-likeness)≥0.18,篩選出活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn),并在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2 疾病靶點(diǎn)與藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取 以“influenza”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/＃)數(shù)據(jù)庫,得到流感疾病靶點(diǎn)。將1.1中藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,并繪制Venn圖。

1.3 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 分別取疾病、方劑、活性成分、靶點(diǎn)作為節(jié)點(diǎn),邊為其關(guān)聯(lián)關(guān)系,借助CytoscapeV3.6.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。另外,將1.2中交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并利用Cytoscape分析節(jié)點(diǎn)度(degree),篩選出核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 借助Metascape(https://metascape.org/)平臺,將1.2中交集靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO生物過程、分子功能、細(xì)胞成分和KEGG通路富集分析,并利用在線作圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分與靶點(diǎn)搜集結(jié)果 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫并限定藥物OB、DL值篩選活性成分,結(jié)果見表1。經(jīng)查重排除后,春溫首方全方共搜集到45種活性成分,163個(gè)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)。

表1 春溫首方中活性成分基本信息

2.2 疾病靶點(diǎn)及藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取結(jié)果 檢索共獲得流感靶點(diǎn)480個(gè)。將2.1中163個(gè)藥物關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)與其取交集,得到46個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.3 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 使用Cytoscape構(gòu)建疾病-方劑-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),得到214個(gè)節(jié)點(diǎn)、637條邊。分析可得知節(jié)點(diǎn)度較大(Degree＞二倍中位數(shù))的關(guān)鍵活性成分有7種:木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、川陳皮素(nobiletin)、刺槐素(acacetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。利用String獲取PPI網(wǎng)絡(luò),其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),邊為蛋白互作關(guān)系,圖中有46個(gè)節(jié)點(diǎn)、454條連線,平均節(jié)點(diǎn)度為19.4。再用Cytoscape分析PPI網(wǎng)絡(luò),并選取節(jié)點(diǎn)度＞27者為核心靶點(diǎn),共得出8個(gè)核心靶點(diǎn)。

2.4 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果 利用Metascape將交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG通路富集分析。其中GO生物過程、分子功能、細(xì)胞成分分別獲得1 028、52、31條結(jié)果;KEGG通路富集分析得出133條結(jié)果。然后設(shè)定P值＜0.01,最小計(jì)數(shù)為3,富集因子＞1.5,分別取其前20、10、7、16的富集項(xiàng),繪制富集氣泡圖。結(jié)果可見:GO生物過程主要為細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、對細(xì)胞因子產(chǎn)生的積極調(diào)節(jié)、分化白細(xì)胞、活化T細(xì)胞等;GO分子功能主要有細(xì)胞因子受體結(jié)合等;GO細(xì)胞成分主要涉及膜筏等;KEGG通路主要包括AGERAGE信號通路、HIF-1信號通路、瘧疾、NF-κB信號通路、HTLV-I感染、單純皰疹感染、JAK-STAT信號通路等。

3 討論

流感屬中醫(yī)“疫病”范疇,也稱“時(shí)行感冒”。《黃帝內(nèi)經(jīng)》載:“五疫之至,皆相染易,無問大小,病狀相似。”[14]描述了疫病的發(fā)病特點(diǎn)。張仲景則將疫病統(tǒng)歸于傷寒[15]?！稖匾哒摗吩?“溫疫之為病,非風(fēng),非寒,非濕,乃天地間別有一種異氣所感。”[16]闡釋了疫病的病因。吳瑭揭諸溫之大綱,細(xì)致劃分疫病,認(rèn)為三焦各自“有風(fēng)溫、有溫?zé)?、有溫疫、有溫毒、有暑溫、有濕溫、有秋燥、有冬溫、有溫瘧”[17]。因此,中醫(yī)對該類疾病有較深刻的認(rèn)識。

本研究所得46個(gè)交集靶點(diǎn)與45種活性成分相關(guān),可見各藥物成分間有協(xié)同作用。分析疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)所得的關(guān)鍵活性成分,其中山柰酚是存在于多種植物中的天然黃酮醇,研究認(rèn)為其可抑制炎性細(xì)胞功能,并抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子,從而發(fā)揮抗炎作用[18];木犀草素可通過AKT/Nrf2和NF-κB途徑對小鼠肺損傷有保護(hù)作用[19],研究證實(shí)其在體內(nèi)和體外均有較強(qiáng)的抗炎活性[20],主要通過包括核因子(NF)-κB途徑中的Src、激活蛋白(AP)-1途徑中的MAPK發(fā)揮作用;黃芩素可通過調(diào)節(jié)AMPK激活表現(xiàn)有效抗流感活性[21],同時(shí)其具有防止小鼠急性肺損傷和炎癥的效果[22]。根據(jù)PPI所得的核心靶點(diǎn),大致可分為半胱天冬酶(CASP3)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAPK14)、白介素(IL-6、IL-10)和前列腺素G/H合酶(PTGS2)。

通過GO和KEGG通路富集分析,得知春溫首方干預(yù)流感的主要生物過程及主要通路,其中生物過程多為免疫反應(yīng)過程;通路中HTLV、單純皰疹為病毒感染,與流感發(fā)病原因相似;而與以上通路關(guān)聯(lián)較多的靶點(diǎn)為IL-6,IL-6是有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,是急性期炎癥反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑,與B細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化有關(guān)[23]。研究顯示,流感的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生IL-6,而抑制IL-6在許多炎性疾病包括病毒感染中具有治療作用[24]。另外,HIF-1信號通路在感染中起到重要作用[25]。NF-κB信號通路是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵之一[26]。JAK-STAT信號通路則是與涉及自身免疫和炎性疾病發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞因子相關(guān)的通路[27]。

綜上所述,通過中醫(yī)理論、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子層面的研究,本文初步揭示了《時(shí)病論》春溫首方通過“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”治療流感的可行性,以及在抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)制,為臨床應(yīng)用中藥治療流感和進(jìn)一步研究提供理論參考。