三相萃取法分離純化竹黃多糖工藝優(yōu)化*

朱 煒，俞婷婷，計(jì)瑋瑋，黃 玲，鈕為民**

（1.湖州市生態(tài)林業(yè)保護(hù)研究中心，浙江 湖州 313000；2.湖州市梁希森林公園管理處，浙江 湖州 313000；3.湖州市國營林場，浙江 湖州 313000）

竹黃菌（Shiraia bambusicola P.Henn.）又名竹花、竹赤團(tuán)子、竹三七、竹繭等，是一種寄生于竹子細(xì)嫩枝桿上的子囊菌[1]，其子座竹黃為傳統(tǒng)中藥，具有止咳祛痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)利濕、補(bǔ)中益氣、活血補(bǔ)血、散瘀通經(jīng)等功效[2]。竹黃菌主要分布于我國南部的江西、浙江、四川、湖南、安徽、貴州、福建、云南等地區(qū)[3]。竹黃多糖是竹黃的有效成分之一，近年來研究表明竹黃多糖具有良好的抗氧化性能和清除自由基能力，對小鼠的四氯化碳急性肝損傷具有保護(hù)作用，具有良好的開發(fā)利用價(jià)值[4]。

目前，多糖的傳統(tǒng)提取工藝為乙醇沉淀法，此方法雖然能提取出大量的多糖，但是存在提取不徹底、原料利用率低、乙醇用量大等問題[5]。三相萃取法原理是通過在粗提液中加入無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑使其形成三相，上相為有機(jī)層，主要提取色素、脂類等極性較小的物質(zhì)；中間相為蛋白質(zhì)提取層；下相為水層，主要提取一些水溶性物質(zhì)[6]。此外，體系中無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑都可回收，且具有操作簡單、高效、體系容量大、可連續(xù)操作、條件溫和等特點(diǎn)[7-8]。三相分離法應(yīng)用了傳統(tǒng)鹽析、共溶劑、等離子體和蛋白質(zhì)滲透沉淀等多種原理，最近幾年才被用到多糖的分離純化中[9-10]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

竹黃子實(shí)體采自浙江省湖州市梅峰鎮(zhèn)短穗竹上；苯酚、硫酸、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鋁、無水乙醇、（NH4）2SO4、叔丁醇均為國產(chǎn)分析醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白購于上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；20B型中藥粉碎機(jī)，南京邦斯特制藥設(shè)備有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL602-S電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 竹黃多糖提取液的制備

將10 g干燥的竹黃子實(shí)體粉碎后過40目篩，按料液比1∶40（g·mL-1）加入蒸餾水，90℃下水浴攪拌提取60 min；連續(xù)提取2次，過濾，合并2次濾液，濾液經(jīng)50℃、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL；濃縮液供三相萃取法分離多糖使用。

1.3.2 三相萃取體系

參照Yan等[10]的方法，取10 mL食用菌水提取濃縮液加入一定量的（NH4）2SO4，然后加入一定體積的叔丁醇配制所需三相體系。磁力攪拌10 min使兩相充分混勻，調(diào)節(jié)pH，以5 000 r·min-1離心10 min加速萃取劑分離過程，于一定溫度下靜置60 min，上相主要為叔丁醇，含有一些色素等雜質(zhì)；中間相主要為蛋白質(zhì)；下相主要是（NH4）2SO4和竹黃多糖[10]。使用移液器將三相各層的溶液分別吸出存于微量量筒中測定體積，后用水稀釋各相溶液，上相、中間相、下相檢測指標(biāo)為蛋白質(zhì)和多糖濃度。

1.3.3 萃取條件的單因素試驗(yàn)

1）（NH4）2SO4添加量的確定

取5組各10 mL提取濃縮液，分別加入（NH4）2SO4使其質(zhì)量濃度為10%、20%、30%、40%、50%后，再各加入15 mL叔丁醇（叔丁醇∶樣液體積比為1.5∶1）；在萃取溫度為25℃，pH 6的條件下萃取60 min；靜置2 h形成三相后，測定各相的相應(yīng)指標(biāo)，考察不同（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對體系中多糖萃取率與蛋白質(zhì)去除率的影響。

2）叔丁醇與樣液體積比的確定

吸取10 mL提取濃縮液于5組試管中，分別加入20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的（NH4）2SO4后，加入不同體積叔丁醇 （0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1）；在萃取溫度為25℃，pH 6的條件下萃取60 min，靜置2 h形成三相后，測定各相的相應(yīng)指標(biāo)；考察不同體積叔丁醇對體系中多糖萃取率與蛋白質(zhì)去除率的影響。

3）萃取溫度的確定

吸取10 mL提取濃縮液于5組試管中，加入（NH4）2SO4，使其質(zhì)量濃度為20%后加入15 mL的叔丁醇（叔丁醇∶樣液體積比為1.5∶1），在萃取溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH 6的條件下萃取60 min后測定各相的相應(yīng)指標(biāo)，考察不同萃取溫度對體系中多糖萃取率與蛋白質(zhì)去除率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)

選擇萃取溫度、叔丁醇添加量、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素所確定的水平范圍。運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。利用Design Expert 8.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。自變量的試驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 分析方法

1）多糖萃取率的測定

采用苯酚-硫酸比色法[11]，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在490 nm處測定樣品吸光度，通過純化前后樣品中多糖含量來確定多糖萃取率（M，%），計(jì)算公式為：

式中：C1為純化后提取液中多糖含量（g）；C2粗提液中多糖含量（g）。

2）蛋白質(zhì)去除率的測定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法[12]，制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，在595 nm處測定樣品吸光度，通過純化前后樣品中蛋白質(zhì)含量來確定蛋白質(zhì)去除率（N，%），計(jì)算公式為：

式中：M1為純化后提取液中蛋白質(zhì)含量（g）；M2粗提液中蛋白質(zhì)含量（g）。

3） 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對竹黃多糖萃取率和蛋白質(zhì)去除率的影響

（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著（NH4）2SO4添加量從10%增加到20%，多糖的萃取率增加，當(dāng)（NH4）2SO4添加量為20%時(shí)，多糖的萃取率最大為87.50%。這可能是由于NH4+和SO42-可以穩(wěn)定大分子間的相互作用，使萃取體系更加穩(wěn)定，多糖能更好地溶解在溶劑中[10]；當(dāng)（NH4）2SO4添加量超過20%，竹黃多糖的萃取量呈減少趨勢，可能由于鹽濃度過高會使多糖和水分子之間的氫鍵作用力被減弱，從而降低了多糖的萃取率。同時(shí)，隨著提取液中（NH4）2SO4添加量的增加，蛋白質(zhì)去除率呈先上升后下降趨勢。在較低鹽濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)去除率上升緩慢，當(dāng)（NH4）2SO4添加量到達(dá)20%時(shí)，蛋白質(zhì)去除率最高為84.81%，鹽離子在較低濃度時(shí)的“鹽溶”效應(yīng)對相的分離有一定的促進(jìn)作用；然而，隨著提取液中（NH4）2SO4添加量繼續(xù)增加，水分子被鹽離子吸引，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的鹽析效應(yīng)[14]。因此提取液中最適（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%。

2.1.2 叔丁醇與樣液體積比對竹黃多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響

叔丁醇與樣液體積比對竹黃多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著叔丁醇添加量的增加，竹黃多糖的萃取率也相應(yīng)增加，當(dāng)叔丁醇與樣液體積比為0.5～1.0時(shí)，竹黃多糖萃取率增加幅度較大，在叔丁醇與樣液體積比為1∶1時(shí)竹黃多糖的萃取率最大為84.32%。這可能是增加的叔丁醇和（NH4）2SO4相互作用的結(jié)果，使多糖萃取率增加；但是當(dāng)叔丁醇與樣液體積比超過1.0后，竹黃多糖的萃取率大幅下降，這可能是叔丁醇的含量過高不利于三相體系的穩(wěn)定；可溶性蛋白質(zhì)去除率隨叔丁醇的添加量增加而逐漸下降[15]，因此提取液中最適叔丁醇∶樣液體積比為 1∶1。

2.1.3 萃取溫度對竹黃多糖萃取率的影響

萃取溫度對竹黃多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)竹黃多糖萃取溫度自20℃升高至40℃，竹黃多糖的萃取率逐漸增大至83.70%，這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高大量的羥基暴露促進(jìn)了更多的氫鍵或鏈接形成。三相萃取溶液體系中分子熱運(yùn)動加快，從而使多糖的親水性增強(qiáng)，這樣竹黃多糖更容易從食用菌中進(jìn)入到萃取溶液中，從而竹黃多糖的萃取率增加；當(dāng)萃取溫超過40℃以后，竹黃多糖的萃取率出現(xiàn)下降。同時(shí)，隨著萃取溫度的增加，蛋白質(zhì)去除率呈先上升后下降趨勢。當(dāng)溫度為30℃時(shí)蛋白質(zhì)萃取率最大為73.10%，因此綜合考慮選擇萃取溫度為40℃為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。選擇萃取溫度（A）、叔丁醇與樣液體積比（B）、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）作為自變量，以竹黃多糖萃取率作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experiment design and results of response surface analysis

利用Design Expert 8.05軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[13]，獲得多糖萃取率對萃取溫度、叔丁醇與樣液體積比和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多元二次回歸方程，確定以多糖萃取率（P，%）為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸模型為：

對上述方程進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

由表3可知，以多糖萃取率為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平，P＜0.000 1；模型的決定系數(shù)R2為0.987 9，說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好；校正決定系數(shù)R2adj為0.972 4，說明該模型能解釋97.24%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率，表3中模型失擬項(xiàng)的P=0.333 6＞0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著；根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，叔丁醇添加量、萃取溫度對響應(yīng)值影響顯著 （P＜0.05），（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）、A2、B2、C2以及AC、BC的交互項(xiàng)對多糖萃取率的影響極顯著（P＜0.01）。各個(gè)因素對多糖萃取率影響大小順序依次為：（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞叔丁醇與樣液體積比＞萃取溫度。

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)曲面圖，并根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，探討萃取溫度、叔丁醇添加量及（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對竹黃多糖萃取率的影響。分別將萃取溫度、叔丁醇添加量及（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的其中一個(gè)因素固定在0水平，得到另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖4～圖6。

從圖4～圖6可以看出，影響竹黃子實(shí)體多糖萃取率的最顯著因素為（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。其次是叔丁醇與樣液體積比。萃取溫度響應(yīng)面弧度變化平緩，說明其對響應(yīng)值影響較小。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[16]。從圖4～圖6可以看出，叔丁醇與樣液體積比與（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)相互之間，萃取溫度與（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)相互之間對多糖萃取率有交互作用的影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design-Expert 8.05分析，得到最佳提取條件為：萃取溫度35.16℃，叔丁醇∶樣液體積比為0.96∶1，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.10%，多糖萃取率理論值可達(dá)93.51%。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實(shí)際試驗(yàn)值之間的相關(guān)性，即檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對竹黃子實(shí)體中多糖萃取率進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)中萃取溫度、叔丁醇∶樣液體積比和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化值分別為35.16℃，0.96∶1，26.10%。通過3次平行試驗(yàn)，測得多糖萃取率分別為90.38%、90.25%、90.67%。實(shí)際多糖萃取率平均值為90.43%，達(dá)到了回歸模型預(yù)測理論值的96.70%。試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測竹黃子實(shí)體多糖萃取率。

3 結(jié)論

以竹黃為原料進(jìn)行試驗(yàn)，利用三相萃取法分離純化竹黃多糖，考察叔丁醇-（NH4）2SO4-水提液體系的三相萃取性質(zhì)，研究了三相體系中的提取液中（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、叔丁醇添加量、萃取液溫度對竹黃提取液中多糖萃取率和蛋白質(zhì)去除率的影響；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化了三相萃取的最優(yōu)工藝。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，竹黃子實(shí)體中多糖的最佳提取條件為：萃取溫度35.16℃，叔丁醇∶樣液（體積）為0.96∶1，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.10%，此條件下的多糖萃取率可得90.43%，蛋白質(zhì)去除率可達(dá)88.45%。三相萃取體系中的無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑都可以回收重復(fù)使用，三相萃取法分離純化竹黃活性成分是一種具有前景的高效分離方法。