李冰瑩 鄭旭彬 胡屹 徐飚

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)流行給全球結(jié)核病控制帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，耐藥率也高于全球平均水平[1]。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)(drug-susceptibility testing, DST)通常被視為耐藥結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)[2]。GeneXpert、線性探針等分子診斷技術(shù)雖能快速診斷耐藥性，但僅能檢測(cè)少數(shù)藥品最常見的耐藥突變位點(diǎn)，無(wú)法提供全面的抗結(jié)核藥品耐藥信息[3-4]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的下降，全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing, WGS)技術(shù)為結(jié)核病耐藥檢測(cè)提供了新的手段。WGS可以在全基因組水平上同時(shí)檢測(cè)耐藥基因的變化信息，受到了世界衛(wèi)生組織的肯定，有廣闊的應(yīng)用前景[5-6]。然而WGS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量龐大，需要運(yùn)用復(fù)雜的生物信息學(xué)才能得到耐藥結(jié)果，給臨床實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)挑戰(zhàn)[7]。因此，WGS的臨床應(yīng)用必須要借助高效、自動(dòng)化的信息平臺(tái)，從而使非生物信息學(xué)專業(yè)的臨床人員可以常規(guī)使用。

最近，研究人員開發(fā)了幾款針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的自動(dòng)化分析工具，只需導(dǎo)入原始測(cè)序數(shù)據(jù)即可得到藥敏試驗(yàn)結(jié)果，克服了WGS在臨床使用上的限制[8-10]。為了指導(dǎo)臨床診斷和治療，這些分析工具必須要有高度的準(zhǔn)確性。但是一方面，已有的研究結(jié)果并不一致，芬蘭的研究表明,TB Profiler v2.8.0、Mykrobe v0.7.0和PhyResSE v1.0(以下簡(jiǎn)稱“TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE”)診斷MDR-TB的敏感度從74%～80%不等，而一項(xiàng)2019年的研究則顯示診斷MDR-TB的敏感度在90%左右[11-12]。另一方面，不同地區(qū)主要流行菌株不同，耐藥相關(guān)基因突變頻率和類型也不同，會(huì)導(dǎo)致耐藥檢測(cè)的準(zhǔn)確性有差異。因此，本研究使用TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE這3種工具對(duì)534株中國(guó)臨床分離菌株進(jìn)行耐藥檢測(cè)，以更好地評(píng)估這些工具的診斷性能。

資料和方法

一、數(shù)據(jù)來(lái)源

在PubMed中利用“whole genome sequencing”“Mycobacteriumtuberculosis”“drug resistance”和“China”等關(guān)鍵詞進(jìn)行組合檢索，篩選2019年5月1日前符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)的研究：(1)對(duì)4種一線抗結(jié)核藥品和至少2種二線抗結(jié)核藥品進(jìn)行了DST；(2)至少對(duì)10株結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行了測(cè)序；(3)均為來(lái)自中國(guó)的結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株；(4)能批量下載測(cè)序數(shù)據(jù)和DST結(jié)果。最終篩選得到符合標(biāo)準(zhǔn)的2項(xiàng)研究，并從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive, NCBI SRA)中下載了這2項(xiàng)研究所上傳的534株結(jié)核分枝桿菌的全基因組序列[13-14]。534株結(jié)核分枝桿菌菌株均為來(lái)自中國(guó)的臨床菌株，表型藥敏試驗(yàn)顯示，457株為耐藥菌株，77株為敏感菌株。

二、軟件工具

評(píng)估的3種結(jié)核分枝桿菌全基因組數(shù)據(jù)分析工具分別是TB Profiler v2.8.0(http://tbdr.lshtm.ac.uk/)、Mykrobe v0.7.0(https://www.mykrobe.com/)和PhyResSE v1.0(www.phyresse.org)。下文中所涉及的TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE均與此處版本相同。這3種工具都不需要使用命令行界面和編程語(yǔ)言，只需把原始測(cè)序數(shù)據(jù)上傳到網(wǎng)頁(yè)或?qū)胲浖纯蓹z測(cè)所有一線抗結(jié)核藥品和大多數(shù)二線抗結(jié)核藥品的耐藥性，具體藥品目錄見表1。

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE操作簡(jiǎn)單，給出的耐藥檢測(cè)結(jié)果簡(jiǎn)單易懂，并且給出了菌株家系信息(表2)。在處理時(shí)間方面，一個(gè)100倍測(cè)序深度的樣本(約450兆)使用網(wǎng)頁(yè)版TB Profiler和 PhyResSE從上傳完成到得到耐藥結(jié)果需要約90 min，而使用軟件版Mykrobe則速度較快，只需要約30 min。在批量操作方面，PhyResSE網(wǎng)頁(yè)版提供批量上傳，TB Profiler和Mykrobe只能在命令行版本批量分析數(shù)據(jù)。此外，TB Profiler和Mykrobe可以根據(jù)用戶個(gè)性化需求修改使用的突變數(shù)據(jù)庫(kù)，從而納入新發(fā)現(xiàn)的耐藥突變，不斷提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。TB Profiler在命令行版本中通過(guò)編輯源代碼來(lái)修改突變數(shù)據(jù)庫(kù)，Mykrobe在命令行版本中通過(guò)使用Python代碼生成器進(jìn)行調(diào)整。

三、評(píng)價(jià)指標(biāo)

以DST結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，使用統(tǒng)計(jì)軟件R(版本3.1.0)計(jì)算敏感度、特異度，包括相應(yīng)的95%置信區(qū)間。

結(jié) 果

一、TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對(duì)一線抗結(jié)核藥品耐藥的檢測(cè)效能

以DST結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，Mykrobe和PhyResSE檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度分別為76.42%(350/458)和76.20%(349/458)，略高于TB Profiler(69.43%，318/458)，三者特異度幾乎相同(表3)。TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測(cè)利福平耐藥的敏感度和特異度均較高，敏感度分別為90.81%(415/457)、87.75%(401/457)和90.81%(415/457)，特異度分別為97.40%(75/77)、96.10%(74/77)和96.10%(74/77)。對(duì)于乙胺丁醇，TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE的敏感度相近，分別為81.61%(213/261)、79.31%(207/261)和79.69%(208/261)，三者特異度也相近，在83%左右。對(duì)于吡嗪酰胺，TB Profiler的敏感度(72.82%，150/206)高于Mykrobe(61.65%，127/206)和PhyResSE(50.97%，105/206)，三者特異度相近，均高于92%。

表1 3種全基因組數(shù)據(jù)分析工具檢測(cè)藥品種類情況

表2 不同性能在3種全基因組數(shù)據(jù)分析工具間的比較

表3 以DST為金標(biāo)準(zhǔn)判斷TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對(duì)一線抗結(jié)核藥品耐藥的檢測(cè)效能

二、TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對(duì)二線抗結(jié)核藥品耐藥的檢測(cè)效能

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測(cè)二線抗結(jié)核藥品耐藥的特異度均較高，而敏感度在不同藥品和工具之間差異較大(表4)。PhyResSE檢測(cè)氟喹諾酮類耐藥的敏感度為88.27%(143/162)，略高于TB Profiler(81.48%，132/162)和Mykrobe(82.10%，133/162)。對(duì)于阿米卡星，PhyResSE的敏感度為60.00%(27/45)，略高于TB Profiler(48.89%，22/45)和Mykrobe(55.56%，25/45)。TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測(cè)耐鏈霉素的敏感度相近，分別為78.77%(256/325)、76.00%(247/325)和79.38%(258/325)。TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測(cè)氟喹諾酮類和阿米卡星耐藥的特異度均高于95%，檢測(cè)耐鏈霉素的特異度略低，分別為88.89%(184/207)、89.37%(185/207)和90.34%(187/207)。根據(jù)DST結(jié)果，本研究納入的菌株中有3株耐貝達(dá)喹啉、12株耐利奈唑胺和35株耐氯法齊明，TB Profiler對(duì)這3種藥品進(jìn)行了耐藥檢測(cè)，但只檢測(cè)了Rv0678和rrl基因上少數(shù)突變位點(diǎn)，沒有檢出耐藥菌株。

表4 以DST為金標(biāo)準(zhǔn)判斷TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對(duì)二線抗結(jié)核藥品耐藥的檢測(cè)效能

討 論

快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性可以指導(dǎo)臨床治療、改善患者預(yù)后、降低傳播風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于控制結(jié)核病至關(guān)重要。使用WGS可以在5 d左右獲得耐藥結(jié)果，顯著減少了耐藥診斷所需的時(shí)間，具有良好的發(fā)展?jié)摿11]。但是WGS數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，不利于臨床人員使用，WGS的臨床應(yīng)用必須要借助高效、自動(dòng)化的數(shù)據(jù)分析工具。本研究評(píng)估了TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE這3種針對(duì)結(jié)核分枝桿菌開發(fā)的全基因組數(shù)據(jù)分析工具的檢測(cè)性能，以利于WGS技術(shù)在結(jié)核病中的應(yīng)用。結(jié)果顯示，TB Profiler、Mykrobe 和PhyResSE總體性能良好，檢測(cè)各種藥品耐藥的特異度均較高，但敏感度在不同的藥品和工具之間差異較大，這與先前的研究結(jié)果相一致[11,15-16]。總體而言，一線抗結(jié)核藥品(PZA除外)、氟喹諾酮類藥品和鏈霉素的耐藥檢測(cè)敏感度較好，其余藥品敏感度較差。

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥的敏感度較低的原因不是工具算法無(wú)法檢測(cè)到菌株的遺傳變異，而是由于分析時(shí)只納入了早期研究發(fā)現(xiàn)的耐藥有關(guān)的點(diǎn)突變，但是近期研究發(fā)現(xiàn)插入與缺失也是吡嗪酰胺耐藥的重要機(jī)制[17]。一項(xiàng)日本的研究表明，通過(guò)手動(dòng)修改TB Profiler等工具的突變數(shù)據(jù)庫(kù)，增加吡嗪酰胺耐藥有關(guān)的插入和缺失，可以顯著提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[18]。手動(dòng)修改突變數(shù)據(jù)庫(kù)不適用于臨床環(huán)境，因此需要開發(fā)者加快更新速度，及時(shí)調(diào)整默認(rèn)的突變數(shù)據(jù)庫(kù)，不斷提高耐藥檢測(cè)的準(zhǔn)確性。但是由于缺少持續(xù)的資金支持，這些工具的維護(hù)和完善面臨挑戰(zhàn)。例如，KvarQ是一款2014年開發(fā)耐藥檢測(cè)軟件，但自從開發(fā)之后未曾進(jìn)行過(guò)更新維護(hù)，影響用戶使用[19]。因此，可考慮采取可持續(xù)的商業(yè)模式，以確保這些工具的臨床實(shí)用性[16]。

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE中只有TB Profiler對(duì)貝達(dá)喹啉、利奈唑胺和氯法齊明進(jìn)行了耐藥檢測(cè)，但是卻沒有檢測(cè)出耐藥菌株。這主要是由于貝噠喹啉等藥品的耐藥機(jī)制尚不清楚，TB Profiler檢測(cè)時(shí)只納入了Rv0678和rrl基因上少數(shù)突變位點(diǎn)，檢測(cè)效果差。這提示對(duì)于貝達(dá)喹啉等敏感度表現(xiàn)不佳的藥品首先要加強(qiáng)耐藥機(jī)制研究，獲得高質(zhì)量的耐藥有關(guān)突變，才能提高耐藥檢測(cè)的準(zhǔn)確性。此外，值得注意的是WGS測(cè)序深度也會(huì)影響耐藥檢測(cè)的敏感度。當(dāng)菌群中存在敏感菌和耐藥菌混合感染時(shí)，表型藥敏試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出1%菌群比例的耐藥，而WGS檢測(cè)限值與測(cè)序深度有關(guān)，測(cè)序深度較淺時(shí)可能會(huì)將混合感染的樣本診斷為敏感[20]。

本研究首次針對(duì)性地納入中國(guó)結(jié)核病患者的臨床分離菌株以更好地評(píng)估TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE的診斷性能。但本研究也存在一定的局限性。首先，貝達(dá)喹啉、利奈唑胺和氯法齊明耐藥菌株數(shù)量較少，可能會(huì)影響敏感度評(píng)估的準(zhǔn)確性。其次，本研究中耐藥菌株占比高，不能反映耐藥率水平，因此，無(wú)法估計(jì)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。

本研究證實(shí)了TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE這3種針對(duì)結(jié)核分枝桿菌開發(fā)的全基因組數(shù)據(jù)分析工具總體性能良好，對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥有較高價(jià)值。但目前還面臨吡嗪酰胺和二線藥品檢測(cè)敏感度低等限制，離大規(guī)模臨床應(yīng)用尚有一段距離，有望在將來(lái)徹底改變耐藥結(jié)核病的快速臨床診斷。為了確保這些工具的臨床實(shí)用性，還需要加強(qiáng)抗結(jié)核藥品耐藥機(jī)制研究(尤其是吡嗪酰胺和二線藥品)，提高耐藥突變數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)量，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。