宋克玉 張琴 王雯菁 時瑞 吳旭平

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)是指除人、牛、麻風(fēng)分枝桿菌外的分枝桿菌，可引起結(jié)核樣病變。由于NTM肺病在臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)等方面與肺結(jié)核很相似，且痰涂片也能找到抗酸桿菌，故易被誤診為耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)或廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)[1]，其治療所用的藥品與結(jié)核病相似，但治療方案大不相同。因此，對比分析NTM和結(jié)核分枝桿菌(MTB)的流行和耐藥情況，對分枝桿菌病的早期鑒別和診療有重要意義。同時，不同國家和地區(qū)MTB耐藥基因的分子生物學(xué)特征各不相同[2-3]，中國各地之間也存在差異，且耐藥相關(guān)基因的研究數(shù)據(jù)較少。筆者收集2017—2019年南京市結(jié)核病定點醫(yī)院收治的分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者的臨床信息、菌種鑒定結(jié)果、藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)情況和耐藥相關(guān)基因突變位點等信息，以了解南京市分枝桿菌耐藥情況，預(yù)測其發(fā)展趨勢，為評估和調(diào)整現(xiàn)有治療方案提供參考。

資料和方法

一、 資料來源

選取2017年1月至2019年12月南京市結(jié)核病防治定點醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院)收治的1719例經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者作為研究對象，收集其基本資料(包括年齡、性別、治療史及是否并發(fā)艾滋病等)，如同例患者同一時間段進行數(shù)次檢查，只采用第一次檢查結(jié)果。共分離1719株分枝桿菌，均進行絕對濃度間接法藥敏試驗，并采用PCR-反向斑點雜交法進行菌種鑒定。其中，308株(17.92%)為NTM，1411株(82.08%)為MTB。本研究已通過南京市第二醫(yī)院倫理委員會的批準，所有數(shù)據(jù)均進行匿名統(tǒng)計。

二、實驗方法

1.菌種鑒定：采用PCR-反向斑點雜交法。使用深圳亞能公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒，嚴格按照說明書操作。采用熱裂解法提取分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株或相應(yīng)痰液、灌洗液標本中的分枝桿菌DNA，經(jīng)擴增后進行變性、雜交、孵育、顯色等步驟，肉眼判讀結(jié)果。該試劑盒可以鑒定出MTB和22種 NTM。

2.藥敏試驗：參照文獻[4]，分別對異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、對氨基水楊酸(PAS)、卷曲霉素(Cm)和左氧氟沙星(Lfx)等9種藥品進行藥敏試驗，用H37Rv標準敏感株進行質(zhì)量控制。以不含藥對照管生長，含藥高、低濃度管均不生長為敏感；低濃度管生長、高濃度管不生長為中度耐藥；高、低濃度管均生長為高度耐藥。本研究中“耐藥”包括中度和高度耐藥。

3.MTB耐藥位點檢測：采用熒光PCR熔解曲線法。使用廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的針對RFP、INH、Sm、EMB、氟喹諾酮類藥品和二線注射類藥品的MTB耐藥突變檢測試劑盒，嚴格按照說明書操作。將部分絕對濃度比例法藥敏試驗得到的表型耐藥MTB菌株提取的DNA經(jīng)擴增和熔解分析后，通過檢測標本與野生型陽性對照的退火溫度(Tm)峰值差異，判斷是否耐藥。標本4個通道的Tm值均與陽性對照的Tm值誤差不超過1 ℃判斷為野生型；標本4個通道任一通道的Tm值與陽性對照相差2 ℃或以上判斷為突變型。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料為偏態(tài)分布，以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”表示；計數(shù)資料以“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

308例NTM感染者年齡范圍7～91歲，中位年齡 [M(Q1，Q3)]為64(54，71)歲，初治患者占26.30%，男性占49.35%，并發(fā)艾滋病者占2.60%。1411例MTB感染者年齡范圍5～94歲，中位年齡 [M(Q1，Q3)]為51(30，64)歲，初治患者占35.29%，男性占72.79%，并發(fā)艾滋病者占5.10%(表1)。

二、耐藥情況

1.總體耐藥情況：MTB感染者中，不同性別組間耐藥率和耐多藥率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；35～歲組耐藥率和耐多藥率高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；復(fù)治者的耐藥率和耐多藥率均高于初治者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；并發(fā)艾滋病者與未并發(fā)者的耐藥率和耐多藥率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 不同臨床特征在NTM感染者和MTB感染者中的分布情況

2.對9種抗結(jié)核藥品耐藥情況：308例NTM感染者對納入研究的抗結(jié)核藥品均顯示不同程度的耐藥，除對EMB耐藥率為40.58%外，對其他8種藥品的耐藥率均達到90.00%以上，復(fù)治患者分離菌株與初治患者分離菌株的耐藥率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。1411株MTB分離菌株對9種抗結(jié)核藥品的耐藥順位依次為INH>Sm>RFP>Lfx>EMB>Am>Km>PAS>Cm；對INH的總耐藥率，以及初治患者分離菌株和復(fù)治患者分離菌株對INH的耐藥率均最高(17.65%、 14.46%、19.39%)；對Cm、PAS、Km和Am的耐藥率均低于5.0%，對任意一線抗結(jié)核藥品耐藥率均高于二線抗結(jié)核藥品。復(fù)治患者分離菌株的總耐藥率，耐多藥率，廣泛耐藥率，對INH、Sm、RFP、EMB和Km的耐藥率、以及對任意一線抗結(jié)核藥品和任意二線抗結(jié)核藥品的耐藥率均明顯高于初治患者分離菌株(表4)。

三、MTB分離株耐藥位點分析

將部分經(jīng)絕對濃度比例法藥敏試驗檢測得到的表型耐藥MTB菌株進一步做耐藥基因突變檢測。RFP耐藥突變主要在rpoB529～533位點，rpoB基因雙位點突變占8.06%(15/186)。INH耐藥突變菌株中，katG基因突變占72.35%(157/217)，其中katG315突變占65.44%，InhA啟動子區(qū)突變占17.97%；ahpC啟動子區(qū)突變占9.68%，0.46%(1/217)菌株發(fā)生ahpC和inhA雙基因突變，0.92%(2/217)菌株發(fā)生ahpC和katG雙基因突變。Sm耐藥突變主要發(fā)生在rpsL43位點，其次是rpsL88位點。EMB耐藥突變主要發(fā)生在embB306位點，其次是embB406位點；embB基因雙位點突變占3.49%。納入研究的91株氟喹諾酮類藥品耐藥突變株全部發(fā)生gyrA88～94位點突變；26株二線抗結(jié)核注射藥品耐藥突變株全部發(fā)生rrs1401位點突變。將絕對濃度法藥敏試驗結(jié)果與基因突變檢測結(jié)果進行比對，MTB分離株對納入研究的5種抗結(jié)核藥品的基因型與表型耐藥符合率均達到85.00%以上(表5)。

表2 不同臨床特征MTB感染者的耐藥情況比較

表3 308株NTM分離株對不同抗結(jié)核藥品的耐藥情況分析

表4 1411株MTB分離株對不同抗結(jié)核藥品的耐藥情況分析

續(xù)表4

表5 MTB分離菌株耐藥基因突變分析

討 論

我國自1990年開展的全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，在所有分枝桿菌培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者中，NTM感染比例呈明顯的上升趨勢，分別為4.9%[5]、11.1%[6]和22.9%[7]。本研究顯示，南京市2017—2019年NTM的檢出率為17.92%，與2002—2010年的4.45%[8]和2011—2013年的5.87%[9]相比，呈動態(tài)快速上升趨勢，和我國NTM的發(fā)病趨勢一致，但低于同期全國調(diào)查水平，呈現(xiàn)明顯地區(qū)特性。NTM發(fā)病率急劇上升的可能原因為人口老齡化及艾滋病患者等免疫功能低下的易感人群增多、NTM引起重視，以及檢測技術(shù)的提高等。本次調(diào)查中，308例NTM感染者男女比例相當，以中老年感染為主，對納入研究的9種抗結(jié)核藥品都有很高的耐藥率，且初復(fù)治患者的耐藥率未見明顯差異。

研究認為，性別和年齡是耐藥結(jié)核病患病的危險因素[10-12]。本次調(diào)查中，結(jié)核病患者年齡分布以中老年為主，男性多于女性。不同性別結(jié)核病患者耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，復(fù)治患者和35～<65歲年齡組患者耐藥率更高。并發(fā)艾滋病是罹患分枝桿菌病和發(fā)生耐藥的危險因素[1]，但本研究未能為該結(jié)論提供可靠證據(jù)，這可能與地域差異、樣本選擇及病史采集不全有關(guān)，還需進一步擴大樣本量深入研究。

細菌產(chǎn)生耐藥性主要原因是耐藥突變菌株產(chǎn)生并選擇性富集[13]。MTB的耐藥極少是自發(fā)突變，95%以上耐藥菌株是在抗結(jié)核藥品選擇下產(chǎn)生的[14]。由于常缺乏藥敏試驗結(jié)果作為參考，加之患者對結(jié)核病防治知識了解不足和藥品不良反應(yīng)等原因，臨床上普遍存在擅自減少藥品品種、減低劑量和間斷使用抗結(jié)核藥品等現(xiàn)象，從而加劇了MTB耐藥的產(chǎn)生。一個地區(qū)初治患者的耐藥率反映該地區(qū)耐藥病菌傳播的嚴重程度，復(fù)治患者的耐藥率反映治療藥品使用和管理是否規(guī)范[15]。本次研究發(fā)現(xiàn)，2017—2019年南京市的MTB分離株耐藥情況具有以下特點：(1)耐藥情況有所好轉(zhuǎn)，但耐多藥率仍比全國基線水平高?？偰退幝?32.10%)和耐多藥率(12.40%)低于2011—2015年本市水平(40.00%和17.48%)[16]，其中，耐多藥率高于全國調(diào)查水平(6.85%)[17]。(2)耐藥結(jié)核病傳播嚴重。初治和復(fù)治患者耐藥率(28.31%，34.17%)、耐多藥率(9.24%，14.13%)和廣泛耐藥率(0.40%，2.63%)均低于2012—2015年本市水平(36.79%和45.24%，12.97%和24.87%，1.62%和3.70%)[16]。其中，初治患者耐多藥率遠高于全國調(diào)查水平(5.71%)[17]，提示耐藥結(jié)核病已在社區(qū)人群中出現(xiàn)傳播，一旦蔓延，后果嚴重。(3)復(fù)治患者比初治患者耐藥情況嚴重。復(fù)治患者的耐藥率、耐多藥率、廣泛耐藥率均明顯高于初治患者。這些數(shù)據(jù)表明南京市耐藥形勢嚴峻，耐藥菌株的原發(fā)傳播依然嚴重，需引起足夠重視；抗結(jié)核治療日趨規(guī)范，減少了獲得性耐藥的產(chǎn)生，仍需要進一步重視用藥前的耐藥性檢測，合理選擇治療方案；同時，應(yīng)加強中老年和復(fù)治患者的督導(dǎo)管理，提高其治療依從性。另外，由于本研究基于結(jié)核病定點醫(yī)院就診人群信息，和全國耐藥基線調(diào)查針對的人群不同，同時篩查的涂陽患者僅占全市一部分，因此，僅能為預(yù)測南京市分枝桿菌耐藥情況提供參考。

本次研究中，納入監(jiān)測的9種抗結(jié)核藥品均觀察到耐藥現(xiàn)象，NTM分離株總體耐藥情況嚴重，除EMB的耐藥率為40.58%外，其他8種藥品的耐藥率均達到90.00%以上，且初復(fù)治患者分離菌株耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；MTB分離株對一線抗結(jié)核藥品耐藥情況比對二線抗結(jié)核藥品的耐藥情況嚴重，復(fù)治患者比初治患者耐藥情況嚴重。MTB分離株對抗結(jié)核藥品的耐藥順位為INH>Sm>RFP>Lfx>EMB>Am>Km>PAS>Cm，INH和RFP的耐藥率均高于13.0%，INH的耐藥順位由2002—2014年的第3位上升為第1位[18]。INH耐藥機制復(fù)雜，耐藥相關(guān)位點眾多，且能增加其他藥品耐藥的可能性[19]。因此INH耐藥研究應(yīng)引起高度重視。當前主流復(fù)治化療方案廣泛加入的Sm耐藥率高達17.15%，提示現(xiàn)有復(fù)治化療方案需重新評估和調(diào)整。二線抗結(jié)核藥品中，Lfx的耐藥率高于其他藥品，可能與Lfx是其他感染性疾病的常用藥物，臨床使用普遍有關(guān)。盡管世界衛(wèi)生組織“關(guān)于耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病治療重大變化”推薦治療方案中首選藥物有Lfx[20]，但基于本地區(qū)Lfx耐藥率較高的現(xiàn)實情況，在使用時應(yīng)重視藥敏試驗結(jié)果。復(fù)治患者對INH、RFP、Sm、EMB和Km的耐藥率均比初治患者高，提示臨床醫(yī)生在對不同類型患者的治療中應(yīng)注意合理配藥。氟喹諾酮類藥品作為抗耐藥MTB的核心藥物，目前已經(jīng)出現(xiàn)較高的耐藥率，本次研究中的耐藥率高達10.70%，這也局限了耐藥結(jié)核病治療藥品的選擇。導(dǎo)致氟喹諾酮類藥品高耐藥率的原因可能有兩點：一是患者患病初期易被誤診為社區(qū)獲得性肺炎，常見的氟喹諾酮類藥品單獨或聯(lián)合用藥易導(dǎo)致延誤診斷和耐藥發(fā)展；二是氟喹諾酮類藥品為劑量依賴型殺菌劑，而目前其有效殺菌劑量并不明確，常用劑量可能偏小，導(dǎo)致菌株耐藥率增加[21]。PAS和二線注射類藥品(Km、Am和Cm)的耐藥率均低于5.0%，部分原因與本院重視根據(jù)耐藥結(jié)核病患者藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)個體化用藥有關(guān)。

MTB耐藥的主要機制是基因突變。本研究檢測部分耐藥MTB分離株對RFP、INH、Sm、EMB、氟喹諾酮類和二線注射類藥品的常見耐藥位點突變，耐藥菌株對各藥品突變頻率較高的位點分別為rpoB529～533、katG315、embB306、rpsL43、gyrA88～94和rrs1401。其中，對INH和EMB的雙位點突變率較高，對氟喹諾酮類和二線注射類藥品因進行檢測的菌株量較少，致使檢測到的突變?nèi)考杏诟哳l突變位點。納入研究的5種藥品的耐藥基因型與絕對濃度比例法得到的耐藥表型符合率較高(均>85.0%)。但由于基因檢測位點不能覆蓋所有的突變位點，或檢測到的突變是不引起耐藥的同義或錯義突變，同時不同方法學(xué)的敏感度差異帶來的判斷偏差，都可能產(chǎn)生耐藥性檢測結(jié)果不一致。因此，患者耐藥與否還是應(yīng)當結(jié)合臨床治療情況進行觀察與分析。