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      瑤藥滿山香總黃酮提取工藝的優(yōu)化

      2020-11-09 03:07:40唐春麗魏江存陸梅元謝臻陳宏夏趙鳳仙
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年16期
      關(guān)鍵詞:總黃酮提取工藝

      唐春麗 魏江存 陸梅元 謝臻 陳宏夏 趙鳳仙

      摘要:采用回流提取法提取滿山香(Schisandra propinqua)總黃酮,通過單因素試驗,考察提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液體積、提取時間對藥材總黃酮含量的影響,采用正交試驗,優(yōu)化提取工藝條件,篩選出滿山香總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明,滿山香總黃酮的最佳提取工藝為60%乙醇、料液比1:40(m: V)、回流提取時間1.0 h。該方法能有效測定滿山香藥材總黃酮的含量,重復(fù)性較好、穩(wěn)定可行。

      關(guān)鍵詞:滿山香(Schisandra propinqua );總黃酮;提取工藝

      中圖分類號:R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

      文章編號:0439-8114 (2020) 16-0126-04

      DOI: 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.028

      滿山香來源于木蘭科植物合蕊五味子[Schisandrapropinqua (WaII.) Baill. var. iutermdida A. C. Smith]的干燥藤莖和根,為廣西常用藥材,具有舒筋活血、消腫止痛的功能,用于治療骨折、慢性胃腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛經(jīng)、外傷出血等病癥[1,2]。以滿山香為主要原料的燈銀腦通膠囊用于中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)、瘀血阻絡(luò)的治療。目前,野生滿山香植物資源種群稀少,蘊藏量小[3];瑤藥滿山香含有木脂素類[4-6]、黃酮類[7,8]、揮發(fā)性[1]等成分。黃酮類化合物是廣譜生物活性物質(zhì),普遍存在于植物中,具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用與生物活性,以及對內(nèi)分泌系統(tǒng)[9]和免疫系統(tǒng)等有很好的保護(hù)作用[10-13]。

      本研究以瑤藥滿山香總黃酮含量為指標(biāo),采用單因素試驗考察了提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液體積、提取時間對提取滿山香藥材總黃酮含量的影響,并采用正交試驗進(jìn)一步優(yōu)選最佳提取工藝,為進(jìn)一步研究滿山香藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的參考依據(jù)。目前,國內(nèi)對滿山香藥材總黃酮含量測定的相關(guān)研究鮮見報道,為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效,本試驗建立滿山香總黃酮的含量測定方法,為后期開發(fā)、利用其藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

      1材料與方法

      1.1儀器

      UV1780型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);XS105D型十萬分之一天平(梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司);KQ5200B超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司);優(yōu)普ULUPURE實驗室超純水儀(上海優(yōu)普實業(yè)有限公司)。

      1.2 材料

      蘆丁,純度>98%,購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等所用試劑均為分析純。藥材采摘于廣西賀州市富川瑤族自治縣,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳勇教授鑒定為木蘭科植物合蕊五味子,經(jīng)52 ℃烘干,備用。

      1.3 方法

      1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥到恒重的蘆丁對照品適量,加60%乙醇溶解,定容至25 mL容量瓶中,搖勻,制成濃度為0.4482 mg/mL的對照品溶液。

      1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取瑤藥滿山香藥材粉末1.0 g,置于100 mL的錐形瓶中,加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇,稱定其重量,水浴回流提取1.0 h,再稱定重量,使用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾,精密量取續(xù)濾液2.0 mL,置于50 mL容量瓶中,依據(jù)總黃酮的測定方法測定其吸光度,用線性方程求出樣品溶液中總黃酮的含量,計算得到滿山香藥材總黃酮含量。

      1.3.3 檢測波長的選擇 精密量取上述對照品溶液3 mL于25 mL容量瓶中,再加入1mL的5%亞硝酸鈉溶液,輕輕搖勻,靜置6 min后加入1 mL的10%硝酸招溶液,搖勻,靜置6 min,再加4%氫氧化鈉溶液10 mL,再加水至刻度,搖勻,放置12 min,以相應(yīng)試劑作空白,采用分光光度法在400~800 nm測定吸收光譜,其最大吸收波長為512 nm。

      1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取“ 1.3.1”的對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL 于 25 mL 容量瓶中,加5%亞硝酸納0.4 mL,放置6 min后,加10%硝酸鉛0.4 mL,放置6 min,再加4%的氫氧化鈉4mL,加水至刻度,搖勻,放置10 min,然后在512 nm測定[18]。

      1.3.5 單因素試驗

      1) 提取方法。取滿山香藥材粉末1.Og,精密稱定,置于錐形瓶中,提取時間1 h、25 mL、60%乙醇為提取條件,分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對藥材進(jìn)行總黃酮提取,考察不同提取方法對滿山香總黃酮提取率的影響。

      2) 乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)。取藥材粉末1.Og,精密稱定,置于錐形瓶中,提取時間1.0 h、25 mL不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、60%、70%和85%)的乙醇溶劑為提取條件,采用回流提取法,分析乙醇溶劑不同體積分?jǐn)?shù)對藥材總黃酮提取率的影響。

      3) 提取時間。取藥材粉末1.Og,精密稱定,置于錐形瓶中,以60%乙醇25 mL為提取條件,采用回流提取法,分析提取時間對藥材總黃酮提取率的影響,設(shè)提取時間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。

      4) 提取液體積。取藥材粉末1.Og,精密稱定,置于錐形瓶中,提取時間1h、60%乙醇為提取條件,采用回流提取法,分析乙醇不同體積對藥材總黃酮提取率的影響,設(shè)計60%乙醇提取體積分別為20、30、40、50、60、70 mL。

      以上單因素試驗按“1.3.2”的操作步驟制備供試品,按“1.3.3”的方法顯色測定。

      1.3.6 正交試驗設(shè)計 從中藥滿山香中提取藥材總黃酮的方法主要為有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)[14-17],本試驗最終采取不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為溶劑的提取方法,根據(jù)單因素考察結(jié)果,設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%)、料液比(1:30、1:40、1:50,m:V,下同)、提取時間(1.0、1.5、2.0 h)這3個條件。根據(jù)正交設(shè)計助手軟件,使用L9(34)正交試驗設(shè)計方法,試驗因素和水平見表1。

      2結(jié)果與分析

      2.1 線性方程的制定

      以吸光度對蘆丁溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=13.042x-0.038 5,R2=0.999 1,在0.008964~?0.071712 mg/mL濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

      2.2方法學(xué)考察

      2.2.1 精密度試驗 精密稱取滿山香藥材粉末1.0g,按“1.3.2”的操作步驟制備供試品,按“1.3.3”的方法顯色測定。于512 nm波長下連續(xù)6次測定其吸光度,結(jié)果為1.06%,小于3.00%,表明該方法精密度良好。

      2.2.2 穩(wěn)定性試驗 取滿山香藥材粉末1.0 g,精密稱定,按照“1.3.2”的操作步驟制備供試品,按“1.3.3的方法顯色測定,測定同一供試液在不同時間下的吸光度,于512 nm波長處分別在0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度,計算藥材的RSD值為2.41%,小于3.00%,吸收度在60 min內(nèi)基本不變,表明樣品在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

      2.2.3 重復(fù)性試驗 精密稱取瑤藥滿山香藥材粉末樣品6份,每份約1.0 g,按“1.3.2”的操作步驟制備供試品,按“1.3.3”的方法顯色測定。于512 nm波長處平行測定其吸光度,計算滿山香藥材總黃酮的平均含量為 22.78 mg/g,RSD 值為 2.79%,小于 3.00%,表明該方法重復(fù)性良好。

      2.2.4 加樣回收率試驗 取同一批次已知總黃酮含量的滿山香藥材粉末(含量為22.78 mg/g)0.5 g,精密稱定,共9份,分成3組,即低、中、高加樣組(0.5 g藥材總黃酮含量的80%、100%和120%加樣,精密加入蘆丁對照品,加樣量分別為9.20、11.40、13.65mg),按“1.3.2”的操作步驟制備供試品,按“1.3.3”的方法顯色測定。于512 nm波長處平行測定其吸光度,計算總黃酮的含量。由試驗結(jié)果分析可知,滿山香藥材的低、中、高加樣組總黃酮的平均回收率分別為 98.78%、100.56%、99.40%,RSD分別為 2.59%、2.04%、2.93% (n=3),表明該方法準(zhǔn)確性良好,結(jié)果見表2。

      2.3單因素試驗結(jié)果

      由圖1可知,不同提取方法對滿山香總黃酮提取率的影響中,回流提取法的提取率最高,故而選擇回流提取進(jìn)行后續(xù)試驗。由圖2可知,60%乙醇回流提取滿山香葉總黃酮的提取率最高。不同提取時間對滿山香總黃酮提取率的影響結(jié)果(圖3)表明,提取時間為1.5 h時,總黃酮提取率最高。由圖4可知,結(jié)果顯示提取液體積為40 mL時,滿山香總黃酮提取率最高。

      2.4 正交試驗結(jié)果與分析

      2.4.1 正交試驗結(jié)果 根據(jù)正交設(shè)計助手軟件、正父試驗結(jié)果(表3)和方差分析結(jié)果(表4)可知,以瑤藥滿山香總黃酮的含量為試驗指標(biāo),由于各試驗因素對滿山香藥材總黃酮提取效果的影響程度不同,乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對滿山香總黃酮的提取工藝有顯著影響,而提取時間對滿山香總黃酮的提取工藝無顯著影響,且各影響因素的大小順序為料液比(5)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(4)>提取時間(C),考慮試驗的效率、時間以及成本,故而選擇提取時間為l.Oh,因此,本試驗最理想的提取方案是,即乙醇體積分?jǐn)?shù)是60%,料液比是1:40,回流提取時間是1.0 h,此時提取效果最佳。2.4.2驗證試驗精密稱取滿山香藥材粉末3份,每份約1.0 g,置于錐形瓶中,測定其總黃酮含量,結(jié)果(表5)表明,采用正交試驗優(yōu)化的工藝提取滿山香藥材總黃酮,其含量平均值為23.53 mg/g,/^D為1.94%〇

      3小結(jié)與討論

      本試驗以滿山香藥材為研究對象,考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液體積和提取時間3個影響因素,瑤藥滿山香總黃酮的提取采用回流提取法,利用正交試驗的方法優(yōu)化瑤藥滿山香總黃酮的最佳提取工藝。前期研究發(fā)現(xiàn),影響瑤藥滿山香總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液體積和提取時間,根據(jù)試驗影響因素的選擇與確定,本試驗采用L9(34)正交試驗設(shè)計的方法,進(jìn)行多次試驗,結(jié)果分析表明,瑤藥滿山香的最佳提取工藝,即采用回流提取法,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1:40,提取時間為1.0 h,此時瑤藥滿山香總黃酮提取效果最佳。

      在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗,建立了滿山香總黃酮提取率的工藝優(yōu)化。方差分析表明,乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比2個因子具有顯著性,各因子對總黃酮含量影響的大小依次為料液比(B)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>提取時間(C)。

      參考文獻(xiàn):

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      收稿日期:2019-11-15

      基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(81360524) ;2019年度廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目(2019KY0341);廣西中醫(yī)藥大學(xué)青年基金項目(2019QN036);廣西然科學(xué)基金項目(2014GXNSFAA118208);國家中醫(yī)藥管理局科研三級實驗室中(壯)藥化學(xué)與質(zhì)量分析實驗室(國中醫(yī)藥發(fā)2009[21]號)

      作者簡介:唐春麗(1980-),女,廣西桂平人,副主任藥師,碩士,主要從事中藥質(zhì)量分析及其藥效機(jī)制研究,(電話)18978913964(電子信箱)12072982891@qq.com;通信作者,魏江存,藥師,碩士,主要從事中藥、民族藥及其制劑質(zhì)量分析和藥效機(jī)制研究,(電子信箱)960837714@qq.com。

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