王修梅

【摘 要】目的：研究在親子鑒定技術(shù)融合細(xì)胞檢測中應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列的效果及可行性。方法：選擇2017年3月至2018年3月于我院義務(wù)獻(xiàn)血的外周血液細(xì)胞，分別實(shí)施細(xì)胞株培養(yǎng)、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離、細(xì)胞融合、DNA提取、短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)增檢測等步驟，對其結(jié)果予以分析和評價(jià)。結(jié)果：已實(shí)施融合的細(xì)胞生長63株（6.3%）、未應(yīng)用融合劑細(xì)胞生長數(shù)為1株（0.50%）?？讛?shù)之中予以擴(kuò)增處理后DNA提取結(jié)果表明，融合成功3個(gè)（7.69%）。人骨髓瘤細(xì)胞株DNA含量為（51.94±5.18）ng/ul，外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA含量為（49.59±5.52）ng/ul，融合成功的細(xì)胞DNA含量為（101.17±10.07）ng/ul。融合成功細(xì)胞DNA含量較高，說明細(xì)胞融合成功。結(jié)論：在實(shí)施親子鑒定技術(shù)之中，對其融合細(xì)胞實(shí)施短串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)，其應(yīng)用效果較好，具有可行性。

【關(guān)鍵詞】短串聯(lián)重復(fù)序列;親子鑒定;細(xì)胞融合

【中圖分類號】R394【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號】1005-0019（2020）20--02

細(xì)胞融合是指將細(xì)胞株進(jìn)行融合處理，其細(xì)胞株來源有所不同，使其成為新的細(xì)胞株，從而改變其原有細(xì)胞株的特性[1]。對細(xì)胞融合后實(shí)施檢測十分重要，一般多采用染色體檢測及篩選，其檢驗(yàn)難度較高，且應(yīng)用時(shí)長較長，應(yīng)用效率較低。鑒于此，為了提升親子鑒定效率及準(zhǔn)確性，將短串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)隔離應(yīng)用于細(xì)胞融合之中，進(jìn)而保障親子鑒定的治療及效率[2]。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017年3月至2018年3月于我院義務(wù)獻(xiàn)血的外周血液細(xì)胞，另應(yīng)用美國種質(zhì)保藏中心細(xì)胞株。所用試劑包括細(xì)胞融合試劑、細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、人類STR 21G擴(kuò)增熒光試劑盒、次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘌呤核試劑[3]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng)方式 人骨髓瘤細(xì)胞株予以解凍，溫度為37攝氏度，解凍成功后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)基之中，充入5%的二氧化氮予以培養(yǎng)，溫度為37攝氏度。每3日更換一次培養(yǎng)液予以傳代，將其中的對數(shù)生長期細(xì)胞予以采集，采集過程中技術(shù)后實(shí)施細(xì)胞融合。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方式 對義務(wù)獻(xiàn)血的外周血液予以常規(guī)檢驗(yàn)，包括艾滋病毒、乙肝病毒、梅毒病毒及丙肝病毒等血液傳播類病毒。對其陰性結(jié)果血液予以檢驗(yàn)。血樣予行離心處理后，取紅細(xì)胞與血漿中的白色細(xì)胞（即白膜），劑量為5ml，應(yīng)用磷酸緩沖鹽溶液予以稀釋，劑量為5ml，加入5ml密度梯度液后加入稀釋后血液。將其實(shí)施離心處理，時(shí)間為30min，離心處理后采集中層細(xì)胞。再次應(yīng)用磷酸緩沖鹽溶液予以清洗，共計(jì)3次，對其細(xì)胞予以計(jì)數(shù)后制備完成。

1.2.3 細(xì)胞融合方式 將分離細(xì)胞放置在試管之中，數(shù)量為106個(gè)，重懸其預(yù)冷細(xì)胞融合液，劑量為125ul，并防止預(yù)冷滅活仙臺(tái)病毒懸液12.5ul，混勻后冰置，時(shí)間為5min，直至細(xì)胞表面吸附滅活仙臺(tái)病毒。將其實(shí)施常規(guī)孵育，溫度為37攝氏度，時(shí)間為15min，期間每5min將其予以混合處理。孵育后輕輕放置次磺嘌呤和胸腺嘧啶核苷混合液，實(shí)施鋪板，每孔放置2000個(gè)細(xì)胞，再次予以培養(yǎng)。3星期后對其克隆成功情況予以觀察，并將其克隆生長的孔位實(shí)施24孔擴(kuò)大性培養(yǎng)，2星期內(nèi)予以細(xì)胞計(jì)數(shù)，提取其DNA情況。

1.2.4 DNA提取方式 予行融合細(xì)胞計(jì)數(shù)后，選取（4.5×105）個(gè)細(xì)胞實(shí)施DNA提取操作，將其重懸于200ul磷酸緩沖鹽溶液之中，并放入200ul裂解液，溫度保持在55攝氏度。時(shí)間為10min。提取后將其放置在吸附柱之中，并對其實(shí)施常規(guī)離心處理，隨即應(yīng)用洗脫液實(shí)施洗滌，劑量為160ul，制備結(jié)束后予以定量檢測[4]。

1.2.5 短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)增檢測方式 按照其檢驗(yàn)試劑盒說明制備擴(kuò)增體系，將其試劑放置于DNA模板之中，預(yù)變性溫度為95攝氏度，時(shí)間為11mim。隨即分別在94攝氏度、59攝氏度、72攝氏度之中分別放置1min，全過程擴(kuò)充至28個(gè)循環(huán)。制備好后將其放置在60攝氏度環(huán)境之中，時(shí)長為1h，待測序檢測期間始終將其放置在4攝氏度環(huán)境之中。

2 結(jié)果

2.1 親子鑒定細(xì)胞融合結(jié)果情況

對形成克隆的細(xì)胞孔數(shù)予以統(tǒng)計(jì)，共計(jì)1000株細(xì)胞中，細(xì)胞生長63株，占比6.3%。未應(yīng)用融合劑的200株細(xì)胞，生長數(shù)為1株，占比0.50%。對其中39個(gè)孔數(shù)之中予以擴(kuò)增處理，并提取其中的DNA，其結(jié)果表明，融合成功3個(gè)，占比7.69%。

2.2 DNA含量檢驗(yàn)情況

人骨髓瘤細(xì)胞株DNA含量為（51.94±5.18）ng/ul，外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA含量為（49.59±5.52）ng/ul，融合成功的細(xì)胞DNA含量為（101.17±10.07）ng/ul。其結(jié)果顯示，融合成功細(xì)胞DNA含量較高，說明細(xì)胞融合成功。

3 討論

親子鑒定技術(shù)在孟德爾遺傳定律基礎(chǔ)之上發(fā)展而來，其子代遺傳信息均能體現(xiàn)于親本之上，隨著當(dāng)前基因擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，通過實(shí)施短串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)予以遺傳標(biāo)記，促使親緣關(guān)系、個(gè)體識(shí)別的工作效率有所增長。傳統(tǒng)細(xì)胞融合方式一般多需對其實(shí)施核型及染色體檢測，但因其檢測效率低下，應(yīng)用范圍受到極大的局限性。鑒于此，本研究合理應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)于細(xì)胞融合之中，短串聯(lián)重復(fù)序列廣泛存在于人體基因中，且具備極高的多態(tài)性特征，短串聯(lián)重復(fù)序列由2至6個(gè)堿基構(gòu)成，作為核心序列之一，串聯(lián)重復(fù)排列后的多態(tài)性水平較高。對于細(xì)胞株特定序列予以標(biāo)記后，通過短串聯(lián)重復(fù)序列檢測能夠區(qū)分細(xì)菌株之間的異同，將此技術(shù)應(yīng)用于親子鑒定之中，能夠確定其親緣關(guān)系。

綜上所述，短串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)是當(dāng)前細(xì)胞融合的重要檢測技術(shù)，能夠提升細(xì)胞融合檢測的質(zhì)量及效率，從而提升親子鑒定技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此，短串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)具有推廣及應(yīng)用的優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)

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