牛OPU卵子體外受精和早期胚胎培養(yǎng)的方法研究

王志仙，朱宏波，張普，馮春濤，藺惠良，劉玉，李樹靜，余文莉

（1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050200；2.北京安伯胚胎生物技術(shù)有限公司，北京 100089；3.河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司，石家莊 050200）

在牛胚胎生產(chǎn)中，通過經(jīng)陰道超聲穿刺吸取卵泡中的卵細(xì)胞（Ovum Pick-Up：OPU）的技術(shù)，完全與體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)相關(guān)聯(lián)，已成為有競爭力的、可替代超數(shù)排卵的一項技術(shù)（IVEP）[1]。據(jù)國際胚胎移植協(xié)會2016年的統(tǒng)計，2016年全球共生產(chǎn)OPU-IVP胚胎666 215枚，超過體內(nèi)胚胎632 638枚的生產(chǎn)數(shù)量，占2016年牛胚胎生產(chǎn)總量的51.29%，比2015年OPU胚胎生產(chǎn)提高了8.73%；鮮胚及凍胚移植總量達(dá)448 113枚，占2016年移植胚胎總量的46.45%。

隨著基因組選擇技術(shù)在牛上的迅速發(fā)展，人們越來越有興趣使用OPU-IVP技術(shù)來增加每個供體的胚胎數(shù)和后代數(shù)，從而增強下一代的選擇強度?；蚪M選擇將DNA標(biāo)記技術(shù)和基因組學(xué)整合到傳統(tǒng)的評價體系中，使經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳進(jìn)展速度提高了一倍，縮短了世代間隔，提高了選擇準(zhǔn)確性[2]。

自O(shè)PU-IVP技術(shù)興起以來，如何優(yōu)化體外胚胎生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，提高OPU胚胎的生產(chǎn)效率，一直是眾多研究的重點。本研究的目的是通過對OPU來源的卵母細(xì)胞使用不同系列的培養(yǎng)液培養(yǎng)、不同精子處理方法、不同脫顆粒細(xì)胞方法，比較其體外受精卵裂率和體外培養(yǎng)桑囊率，以從胚胎生產(chǎn)效率和操作簡便程度兩方面綜合考慮，確定適合的培養(yǎng)液系統(tǒng)和操作方法，為進(jìn)一步建立完善、高效的OPU胚胎生產(chǎn)體系提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及設(shè)備

活體采卵操作系統(tǒng)（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；采卵針（MISAWA）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 3131、Thermo 371，Thermo公司）；恒溫臺（HP-4530，HOTPLATE）；臺式離心機（L-550,湘儀離心機儀器有限公司）；生物顯微鏡（OLYMPUS SZ-STS）；移液槍（Eppendorf）；35mm培養(yǎng)皿（FALCON公司）；15mL、50mL離心管（Corning公司）；0.22μm濾器（美國Millipore公司）。

1.2 培養(yǎng)液系統(tǒng)

1.2.1 成品液

從美國MOFA公司購買的OPU全流程溶液（表1）。

表1 美國MOFA公司OPU胚胎生產(chǎn)系列溶液

1.2.2 自配液系統(tǒng)

本試驗所用TCM 199購自Gibco、胎牛血清購自賽默飛，其他試劑均購自Sigma。采卵液：0.22mg/mL丙酮酸鈉，3.58mg/mL Hepes-鈉，0.1mol/mL TCM199（10X），0.1461mg/mL L-谷氨酰胺，0.168mg/mL NaHCO3，0.01mg/mL肝素，0.060mg/mL青霉素，0.130mg/mL鏈霉素。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液：以TCM199(1x)為基液，加入10%FBS，0.01IU/mL FSH，0.01IU/mL LH，1μg/mL 雌二醇，50μg/mL肝素，100ng/mL IGF，50ng/mL EGF，雙抗各100IU/mL。洗精液：以BO液為基液，加入10mmol/L咖啡因。受精液：以BO液為基液，加入20mg/mL BSA，20μg/mL肝素，雙抗各100IU/mL。胚胎體外培養(yǎng)液：以mCR1aa為基液，加入6mg/mL BSA，20μL/mL EAA(50X)，10μL/mL Non-EAA(100X)，1.5mg/mL谷氨酰胺。

1.3 活體采卵

用石家莊天泉良種奶牛有限公司飼養(yǎng)的空懷或妊娠3個月以內(nèi)的泌乳牛，在非超排情況下或經(jīng)CIDR-FSH程序處理后40h，用深圳邁瑞B(yǎng)超儀（DP-50Vet）和B超探頭（65C15EA）安裝17G×600mm長針（MISAWA，日本）或18G短針（DI-0207-10，WTA，巴西），通過陰道穿刺采集OPU卵子。

1.4 體外培養(yǎng)

1.4.1 卵子體外成熟培養(yǎng)

取35mm培養(yǎng)皿，用完全成熟液做20μL的液滴，做6滴，覆蓋3.5mL礦物油；之后，在每個20μL液滴中再加入30μL完全成熟液，做成50μL培養(yǎng)液滴。將培養(yǎng)盤放入38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱平衡3～5h。將用洗卵液洗好的COCs放入微滴中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24h。

1.4.2 精子處理方法

精子梯度離心法： 配制90% PS和45% PS的精液梯度離心液，進(jìn)行梯度離心。第一次離心：700g、15min，去除上清液，留下一團(tuán)約100μL的沉淀物，加900μL平衡好的受精液，將其混勻；第二次離心：300g、5min，去除上清液，留下一團(tuán)約50μL的沉淀物。

精子非梯度離心法：在15mL離心管中加6mL洗精液及解凍后精子，進(jìn)行兩次離心：600g、6min。兩次離心之間吸出上清液并補加相同體積洗精液，兩次離心后輕輕吸出全部上清液，留下一團(tuán)約50μL的沉淀物。

上述兩種方法都要使用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行精子計數(shù)。調(diào)節(jié)離心后精子濃度。

1.4.3 體外受精培養(yǎng)

成品液體外受精培養(yǎng)：取35mm培養(yǎng)皿，用完全受精液做50μL的液滴，做6滴，覆蓋3.5mL礦物油；之后，在每個50μL液滴中再加入48μL完全受精液，做成98μL培養(yǎng)液滴。將培養(yǎng)盤放入38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱平衡3～5h。把用受精液洗好的成熟卵子放入微滴中，加2μL的精子懸液到每個受精滴中，使精子最終濃度為1×106/mL。將受精盤放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～22h。

自配液體外受精培養(yǎng)：取35mm培養(yǎng)皿，用完全發(fā)育培養(yǎng)液做50μL的液滴，做6滴，覆蓋3.5mL礦物油，將培養(yǎng)盤放入38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱中平衡3～5h。把用受精液洗好的成熟卵子放入微滴中，加50μL的精子懸液到每個受精滴中，使精子最終濃度為1×106/mL。將受精盤放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～16h。

1.4.4 脫顆粒方法

機械洗滌法：準(zhǔn)備4個35mm培養(yǎng)皿，其中均充入2/3平衡好的剝卵液，分別標(biāo)注0、1、2、3；將假定的受精卵放入35mm培養(yǎng)皿中，用100μL移液槍輕輕吹打，直至卵丘細(xì)胞剝脫，然后依次在1、2、3號培養(yǎng)皿中洗卵。

渦流器震動法：把預(yù)溫到38.5℃的BoviPRO 體外培養(yǎng)洗液點滴到培養(yǎng)皿里；將合子依次在 BoviPRO 體外培養(yǎng)洗液滴中轉(zhuǎn)移洗滌之后放入40μL的體外培養(yǎng)洗液的1.5mL的離心瓶中；把離心瓶置渦流器上渦流2min；往離心瓶中加入500L體外培養(yǎng)洗液沖洗瓶壁，保證合子得到全部收復(fù)。

1.4.5 體外發(fā)育培養(yǎng)

將用完全發(fā)育培養(yǎng)液洗好的假定受精卵放入微滴培養(yǎng)盤，在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，在第3天時快速統(tǒng)計卵裂率，第7天統(tǒng)計桑囊率。以上各步驟的微滴培養(yǎng)中，每滴里卵子或受精卵不超過10枚。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，百分?jǐn)?shù)比較時經(jīng)反正旋轉(zhuǎn)化后采用方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。每頭牛為一個重復(fù)處理，培養(yǎng)COCs數(shù)小于5枚的在統(tǒng)計數(shù)據(jù)中剔除。

2 結(jié)果與討論

2.1 美國進(jìn)口OPU成品液與自配溶液的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

表2 美國進(jìn)口OPU成品液與自配溶液的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

本試驗成品液組從活體采卵到OPU胚胎體外培養(yǎng)全過程全部使用美國MOFA公司OPU胚胎生產(chǎn)系列溶液，自配液組在OPU胚胎生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中所用的溶液全部用Sigma制劑自行配制。兩組IVC培養(yǎng)均在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如表2所示，成品培養(yǎng)液與自配液的卵裂率和桑囊率之間無顯著差異（P＞0.05）。雖然在實際操作中采用成品液能簡化實驗操作，提高穩(wěn)定性，但自配液可以大大降低生產(chǎn)成本。同時，基于建立自主研發(fā)培養(yǎng)體系的目標(biāo)，很有必要進(jìn)一步對自配液的成分進(jìn)行篩選優(yōu)化。

2.2 不同精子處理方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

表3 不同精子離心方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

本試驗兩組全部采用自配溶液，在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如表3所示，兩種精子處理方法獲得的精子懸液對OPU卵子的受精能力無顯著差異（P＞0.05）。梯度離心法是規(guī)范的操作方法，離心效果穩(wěn)定。在實際操作中非梯度離心法更簡便易行，成本較低，但需要操作快速、準(zhǔn)確，以免活精子與死精子再度發(fā)生混合。

2.3 不同脫顆粒細(xì)胞方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

表4 不同脫顆粒細(xì)胞方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

本試驗兩組全部采用成品液，在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如表4所示，兩種脫顆粒細(xì)胞方法的合子回收率、卵裂率、桑囊率均無顯著差異（P＞0.05）。渦流器震動法相對更快、更容易脫凈顆粒細(xì)胞，但需要掌握適合的震動力度和時間、液體容量等參數(shù)，否則容易損傷和丟失卵子。機械法操作比較簡單，但有時顆粒細(xì)胞不易吹打干凈，需要稍長時間。試驗顯示，在技術(shù)嫻熟的情況下，兩種方法都可獲得較好的效果。當(dāng)卵子達(dá)15枚以上時選擇渦流器震動法脫顆粒細(xì)胞效率更高。

3 討論

本試驗對卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中不同的培養(yǎng)液、不同的精子處理方法以及不同的脫顆粒細(xì)胞方法進(jìn)行了對比，結(jié)果表明，進(jìn)口成品培養(yǎng)液的桑囊率高于自配溶液（36.78% vs 24.10%），但差異不顯著，不同的精子離心方法和扒卵方法也沒有顯著差異。在實際操作中采用成品液能簡化操作，提高穩(wěn)定性和效率。自配液不僅可以大大降低生產(chǎn)成本，而且可以根據(jù)不同的實驗環(huán)境對自配液的成分進(jìn)行篩選優(yōu)化，實現(xiàn)建立自主研發(fā)培養(yǎng)體系的目標(biāo)。

牛的精子離心大多采用兩次離心法[3]。因為凍精或鮮精中含有許多可能阻礙受精的物質(zhì)，如保護(hù)劑、精清、稀釋液、死精及一定量的細(xì)菌等，對精子進(jìn)行洗滌有助于篩選出高活力的精子及減少細(xì)菌污染的可能性。采用90%和45% Percoll 兩種濃度形成梯度，可有效地去除精液中的白細(xì)胞、生精細(xì)胞、死精子、畸形精子等成分，能提取到高活力精子，明顯提高精子前向運動率[4]。但也有研究報道，離心對精子DNA 完整性的改變并不是單向的，甚至有部分參數(shù)比處理前更差[5]，離心過程容易對精子產(chǎn)生損傷，離心時間越長精子活力越低[6]，離心過程中額外產(chǎn)生的氧化活性物質(zhì)，包括超氧陰離子、過氧化氫、氫氧基、過氧羥自由基等可引起DNA的損傷[7]。本試驗采用不同的方法對精子進(jìn)行處理，結(jié)果表明沒有顯著差異。梯度離心法是規(guī)范的操作方法，離心效果穩(wěn)定。非梯度離心操作更加簡單，選擇適當(dāng)?shù)碾x心力不僅能富集精子提高精子活力，還能得到更多DNA完整的精子，保證良好的受精效果。

卵子受精前顆粒細(xì)胞通過自分泌和旁分泌影響牛體外受精效果，在體外受精前，成熟卵母細(xì)胞部分脫除卵丘細(xì)胞組，體外受精胚胎卵裂率顯著高于不脫除卵丘細(xì)胞組[8]。據(jù)報道，體外受精后不同顆粒細(xì)胞脫除方法對胚胎發(fā)育也有一定影響，采用振蕩法脫除顆粒細(xì)胞的卵裂率和囊胚率均高于機械法[9]。采取人工機械吹打脫除卵丘細(xì)胞，操作耗時長且效率較低，卵母細(xì)胞過長時處于外界環(huán)境容易造成卵母細(xì)胞死亡或影響后期發(fā)育。本試驗中兩種方法的卵裂率和桑囊率差異均不顯著。而且采用振蕩法脫顆粒需要將胚胎放入離心管中利用渦流器震動脫除顆粒細(xì)胞，存在胚胎丟失風(fēng)險。但在技術(shù)嫻熟的情況下，兩種方法都可獲得較好的效果。