李玲芳 王 琦

(太原工業(yè)學院化學與化工系，太原 030008)

藥品和個人護理產品(pharmaceuticals and personal care products，PPCPs)是日常生活中經常用到的一類化學產品，然而由于過度和不當?shù)氖褂?，它們近年來已經被列入了新型水污染物的行列[1]。藥品污染往往通過尿液、排泄物、生活廢水、污水、肥料等途徑進入環(huán)境中[2]，嚴重威脅著環(huán)境安全和人類健康[3]。D對映體形式的青霉胺(D-enantiomeric penicillamine，D-PA)是臨床上治療威爾遜氏病的關鍵藥物，但是它同樣能夠引起一些如皮疹、潰瘍、味覺失靈，甚至于免疫相關的血管炎等疾病[4,5]。因此，測定人體體液樣品中的青霉胺含量具有重要意義。目前，測定青霉胺的方法主要有高效液相色譜法[6]、毛細管電泳法[7]、電化學傳感方法[8]、化學發(fā)光法[9]、紫外可見吸收光譜法[10]和熒光光譜法[11-13]等。其中，熒光分析法由于其快速、靈敏、多樣化的優(yōu)點備受關注并廣泛應用于青霉胺的測定。

碳點(carbon nanodots，CDs)是一種近年來備受關注的新型熒光材料。它具有優(yōu)異的發(fā)光性能、抗光漂白、低毒性和高生物相容性，因此在光學傳感領域表現(xiàn)出了優(yōu)越性。碳點表面帶有豐富的官能團，且易于后修飾，因此碳點能夠構建出各種各樣類型的傳感模式，已經成功地應用于熒光檢測金屬離子[14]、陰離子[15]、生物小分子[16]等領域。同樣地，諸如四環(huán)素[17]、諾氟沙星[18]、磺胺嘧啶[19]、甲硝噠唑[20]等藥物也都能夠通過碳點熒光識別。對于基于碳點的青霉胺熒光識別，科研人員也進行了大量的研究。Yuan等[21]通過水熱法制備了熒光碳點并發(fā)現(xiàn)汞離子能夠猝滅其熒光，隨后基于汞離子和青霉胺的親和力使得熒光恢復，由此建立了碳點-汞離子-青霉胺的熒光邏輯門模式來測定青霉胺。Ensafi等[22]從藏紅花制備得到了碳點，并利用青霉胺與銅離子結合形成的配合物吸收碳點熒光的原理，基于內濾效應建立了測定青霉胺的熒光猝滅識別模式。Gunjal等[23]從水果殼制備得到了熒光碳點，并通過鐵離子猝滅它的熒光，而加入青霉胺后，它能與鐵離子結合使得熒光恢復，由此建立碳點-鐵離子-青霉胺熒光開關識別模式。在這些報道中，研究人員都關鍵性地利用了青霉胺與金屬離子強烈的配位作用[24]，通過金屬離子的輔助建立基于碳納米點的熒光識別模式。

受上述工作啟發(fā)，本工作從半胱氨酸出發(fā)，一步熱解法制備了熒光碳點。盡管半胱氨酸作為前驅體制備碳點的工作已有所報道[25]，但這些工作往往需要通過水熱[26]、超聲[27]或微波[28]等手段，設備復雜、耗時較長。我們通過一步熱解法制備碳點，具有簡便快速的優(yōu)點。該碳點表現(xiàn)出了與銀離子的結合趨勢，使得后者通過光誘導的電子轉移(photoinduced electron transfer，PET)有效地猝滅了碳點熒光。在此基礎上引入青霉胺后，由于它與銀離子強烈的結合作用，使得銀離子離開碳點表面進而實現(xiàn)熒光恢復。由此建立了銀離子輔助的碳點熒光點亮型識別模式測定青霉胺的新方法。銀離子首次被用來構建熒光開關以識別青霉胺，這對于青霉胺的分析測定是一個有效的補充。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

L-半胱氨酸(99%)、D-青霉胺(98%)購自阿拉丁試劑有限公司；硝酸銀(AR)購自麥克林試劑公司；氫氧化鈉及其它試劑均為國產分析純；實驗用水為二次去離子水；尿液樣品取自于健康的志愿者并且在測試前過濾稀釋50倍。

所用儀器有JEM-F200型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；ZS90型激光納米粒度儀(英國Malvern公司)；XSAM 800型X射線光電子能譜儀(英國Kratos公司)；F-7000熒光分光光度計(日本Hitachi公司)；TU-1901型紫外-可見分光光度計(中國普析公司)；FLS 1000型熒光光譜儀(英國Edinburgh公司)。

1.2 碳納米點的合成方法

從半胱氨酸出發(fā)，通過熱解法一步制備熒光碳點。首先，將1 g半胱氨酸固體粉末均勻平鋪于燒杯底部并放置在加熱器上，在300℃下加熱5 min。在得到的棕黑色固體中加入4 mL 100 mg·L-1的氫氧化鈉溶液浸泡30 min后，置于超聲清洗機中分散。接著將獲得的分散液以5 000 r·min-1離心10 min除去大顆粒，然后將獲得的上清液裝入截留分子量2 000 KDa的透析袋中在去離子水中透析24 h進一步純化碳點溶液。最后，得到的碳點溶液保存在冰箱中用以后續(xù)的表征和測量。

1.3 熒光點亮型檢測青霉胺

基于碳點-銀離子體系的熒光點亮型檢測青霉胺在中性條件下測定。將100 μL上述碳納米點溶液加入到700 μL去離子水中，接著加入100 μL濃度為5 mmol·L-1的新鮮配制的銀離子溶液，混勻后立即加入100 μL不同濃度的青霉胺溶液或去離子水(作為空白對照)，混勻后立即測定其在360 nm激發(fā)下440 nm處的熒光強度。儀器狹縫寬度均設置為5 nm。所有靈敏度和選擇性測試全部平行測定3次。

1.4 尿液樣品的檢測

尿液樣品取自健康的志愿者。將100 μL樣品加入到含有碳點溶液(100 μL)、銀離子溶液(0.5 mmol·L-1)和已知濃度的標準青霉胺溶液(濃度分別為30.00、100.00、400.00 μmol·L-1)的去離子水中，保持最終體積為1 mL?；靹蚝鬁y定所得樣品溶液在360 nm激發(fā)下440 nm處的熒光強度，并計算其加標回收率。

2 結果與討論

2.1 碳納米點的表征

圖1A所示為碳點的高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)圖片。從圖中可以觀察到均勻分散的顆粒并且表現(xiàn)出球狀的形貌，尺寸小于5 nm。插圖為單個碳點的HRTEM圖，圖中并未觀察到明顯的晶格條紋，證明該碳點為無定型態(tài)。圖1B所示為碳點溶液的動態(tài)光散射納米粒度分布，結果表明該納米顆粒的尺度分布在2.33～4.85 nm之間，平均粒度為3.12 nm。圖1C所示為碳點溶液的紫外可見吸收光譜圖，圖中表明碳點在200～400 nm處表現(xiàn)出了寬的吸收(黑線)，這是由于碳點的芳香結構中的π→π*電子躍遷和羰基氧原子上的n→π*電子躍遷引起的[29]。而單獨的半胱氨酸(紅線)并沒有吸收。插圖中黃色溶液即為制備所得的碳點溶液。圖1D所示為該碳點溶液在不同波長的激發(fā)光下的熒光發(fā)射光譜，結果表明該碳點表現(xiàn)出了激發(fā)依賴的熒光發(fā)射性能，這個現(xiàn)象是由碳點的尺寸效應和發(fā)射位點的分布共同引起的，此類現(xiàn)象在先前的工作中也有所報道[30]。由圖可知，碳點在360 nm的激發(fā)下在440 nm處有最為明顯的熒光發(fā)射。上述結果表明，從半胱氨酸一步熱解法制備得到的碳點表現(xiàn)出了優(yōu)良的熒光性能，為其作為熒光探針進行分子識別奠定了基礎。

為了研究半胱氨酸為前驅體制備的碳點的元素組成，我們測試了材料的X射線光電子能譜(XPS)。圖2A所示為碳點的X射線光電子能譜全譜掃描圖，圖中明顯地顯示出了 C1s、N1s、O1s、S2s和S2p的特征峰，沒有出現(xiàn)其他雜質峰，證明該碳點是由碳、氮、氧、硫元素組成。圖2B所示為C1s的能譜圖，圖中擬合曲線表明材料中C有3種不同的結合狀態(tài)，284.8、286.1、287.7 eV處明顯的分峰分別對應于C=C、C-S、C=O/C-O的特征峰。圖2C所示為O1s的能譜圖，圖中擬合曲線出現(xiàn)531.0和532.5 eV兩個分峰，它們分別對應于C=O和C-O-H/C-O-C的特征峰。N1s的能譜(圖2D)擬合曲線出現(xiàn)了399.2和400.2 eV兩個分峰，它們對應于C-N-C和N-H特征峰。在S2p的能譜(圖2E)的擬合曲線中，可以觀察到163.1和163.9 eV兩個分峰，它們分別對應于C-S/R-S-H和Ph-S的特征峰。上述結果證明了本方法制備的碳點的元素組成和結合形式。

圖1 碳點的(A)HRTEM圖(插圖為單個碳點的HRTEM圖)、(B)動態(tài)光散射粒度分布圖、(C)紫外可見吸收光譜圖(插圖為制備所得的碳點溶液)和(D)不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜圖Fig.1 (A)HRTEM image(Inset:HRTEM of single CDs),(B)dynamic light scattering size distribution,(C)UV-Vis absorption spectrum(Inset:image of as-prepared CDs solution),and(D)fluorescence emission spectra under different excitation of as-prepared CDs

圖2 碳點的XPS譜:(A)全譜、(B)C1s分譜、(C)O1s分譜、(D)N1s分譜和(E)S2p分譜Fig.2 XPS spectra of as-prepared CDs:(A)full scan,(B)C1s,(C)O1s,(D)N1s and(E)S2p

2.2 Ag+和D-PA對CDs熒光性能的影響

圖3 (A)半胱氨酸制備碳納米點和銀離子輔助的碳點-銀離子-青霉胺熒光開關示意圖;(B)碳點(黑色)、碳點+銀離子(紅色)、碳點+銀離子+青霉胺(藍色)溶液的熒光發(fā)射光譜圖;(C)碳點、碳點+銀離子、碳點+銀離子+青霉胺溶液在365 nm的紫外燈照射下的照片F(xiàn)ig.3 (A)Schematic illustration of synthesis of CDs and Ag+assisted CDs-Ag+-D-PA fluorescence switch;(B)Fluorescence spectra of CDs(black),CDs+Ag+(red)and CDs+Ag++D-PA(blue),respectively;(C)Photographs of CDs,CDs+Ag+and CDs+Ag++D-PA under UV(365 nm)illumination

圖3A所示為半胱氨酸一步法熱解制備碳點和銀離子輔助的碳點-銀離子-青霉胺熒光開關的示意圖。有報道稱，以半胱氨酸為前驅體制備的碳點表面富含巰基[31]，得益于銀離子與巰基之間的結合作用[32]，銀離子能夠首先結合到碳點表面，通過光誘導電子轉移有效地猝滅碳點的熒光；進一步引入青霉胺后，青霉胺分子與銀離子配位結合，使得后者離開碳點表面，實現(xiàn)了碳點的熒光恢復。基于此，本工作建立了銀離子輔助的碳點熒光點亮型識別青霉胺的模式。圖3B所示為碳點(黑色)、碳點+銀離子(紅色)、碳點+銀離子+青霉胺(藍色)溶液在360 nm激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜圖。圖中結果表明，銀離子加入后引起了碳點熒光強度的降低，而繼續(xù)加入青霉胺后，碳點的熒光又在一定程度下得以恢復。圖3C所示為碳點、碳點+銀離子、碳點+銀離子+青霉胺溶液在365 nm的紫外燈照射下的照片。由圖可知，碳點溶液發(fā)射出明亮的藍色熒光，而加入銀離子后，藍色的熒光強度明顯減弱，進一步加入青霉胺后藍色又呈現(xiàn)出恢復的狀態(tài)。上述結果表明，銀離子加入碳點溶液后通過熒光猝滅實現(xiàn)“關”的狀態(tài)，而青霉胺通過配位使得熒光恢復實現(xiàn)“開”的狀態(tài)，由此建立基于碳納米點的熒光開關。

為了研究熒光傳感的機理，我們測試了碳點(黑色)、碳點+銀離子(紅色)、碳點+銀離子+青霉胺(藍色)溶液在440 nm處的時間分辨熒光衰減光譜(圖4)。通過表1的擬合數(shù)據(jù)，我們可以看出碳點、碳點+銀離子、碳點+銀離子+青霉胺的熒光壽命分別是5.02、3.98、5.03 ns。結果表明，碳納米點在加入銀離子后熒光壽命有了明顯的減小，而青霉胺加入后壽命又回到初始狀態(tài)，此結論說明銀離子對于碳點的熒光猝滅屬于動態(tài)猝滅。有報道稱，重金屬離子能夠通過光誘導電子轉移猝滅碳點熒光，在此過程中，碳點和金屬離子之間形成了一種可以返回基態(tài)但不發(fā)射光子的復合物[33]。因此，在本工作中，結合到碳點表面的銀離子通過光誘導電子轉移猝滅了碳點熒光。而青霉胺具有優(yōu)異的與重金屬離子配位的能力[24]，它能夠與銀離子配位結合使得后者離開碳點表面，進而打斷了猝滅劑與碳點之間的電子轉移，使得碳點熒光實現(xiàn)恢復。因此，銀離子輔助的碳點熒光點亮型識別青霉胺是由銀離子光誘導電子轉移和青霉胺配位作用共同來實現(xiàn)的。

圖4 碳點(黑色)、碳點+銀離子(紅色)、碳點+銀離子+青霉胺(藍色)溶液在440 nm處的時間分辨熒光衰減光譜圖Fig.4 Time-resolved fluorescence decay spectra at 460 nm from CDs(black),CDs+Ag+(red)and CDs+Ag++D-PA(blue),respectively

表1 多指數(shù)熒光衰減擬合參數(shù)Table 1 Parameters of multi-exponential fitting to the fluorescence decay

2.3 體系酸度對熒光識別青霉胺的影響

基于上述青霉胺響應的熒光恢復能力，將該銀離子輔助的碳點熒光點亮型探針用于青霉胺的測定。由于銀離子和青霉胺能夠在室溫下迅速引起碳納米點熒光的改變，因此體系的酸度可能會是影響青霉胺測定的關鍵因素?？紤]到銀離子在堿性條件下會沉淀析出，我們考察了酸性和中性條件下不同pH值對此熒光開關的影響。圖5A所示分別為碳點(黑色)、碳點+銀離子(紅色)、碳點+銀離子+青霉胺(藍色)溶液在不同pH值去離子水中的熒光強度。通過計算，圖5B所示為不同pH值下的熒光恢復效率(ΔF/F0，ΔF為加入青霉胺前后 CDs-Ag+體系的熒光強度差值，F(xiàn)0為碳點初始的熒光強度)。結果表明，隨著pH值增加，熒光恢復效率也逐漸提高，在pH=7處達到最佳。這是由于青霉胺的配位作用主要來源于氨基和巰基，在酸性條件下氨基質子化，孤電子對與氫離子配位，因此失去了與金屬離子空軌道配位的能力，進而使得青霉胺與銀離子的結合能力下降，最終導致了熒光恢復效率的減小。綜上所述，熒光恢復效率在pH=7時達到最佳，因此我們后續(xù)測定青霉胺在中性條件下進行。

圖5 (A)碳點(黑色)、碳點+銀離子(紅色)、碳點+銀離子+青霉胺(藍色)溶液在不同pH值下的熒光強度;(B)熒光開關在不同pH值下的熒光恢復效率(ΔF/F0)Fig.5 (A)Fluorescence intensity of CDs,CDs+Ag+and CDs+Ag++D-PA solutions under different pH values;(B)Fluorescence recovery efficiency(ΔF/F0)of the switch under different pH values

2.4 標準曲線及選擇性

在上述最佳條件下，圖6A所示為青霉胺濃度依賴的熒光線性響應。結果表明，碳點-銀離子體系的熒光恢復效率與青霉胺的濃度在8～500 μmol·L-1的范圍內呈現(xiàn)線性關系，線性方程為ΔF/F0=0.012 84+0.000 695 7c(R2=0.998 7)，其中c為青霉胺濃度(μmol·L-1)，檢出限為 5.62 μmol·L-1(3σ)。圖6B所示為碳點-銀離子體系在不同濃度青霉胺存在時的熒光光譜，可以看出隨著青霉胺濃度逐漸增加，熒光強度逐漸增強。進一步，我們研究了碳點-銀離子熒光開關測定青霉胺的選擇性。如圖7所示，我們考察了一些可能共存的金屬離子、代謝產物和氨基酸對體系熒光恢復效率的影響。由圖中可知，除青霉胺表現(xiàn)出明顯的熒光恢復之外，其他等濃度的干擾物并未對碳點產生熒光恢復，證明了該銀離子輔助的碳點熒光開關對于青霉胺的識別具有良好的選擇性。

圖6 (A)碳點-銀離子熒光開關測定青霉胺的標準曲線;(B)碳點-銀離子體系在不同濃度的青霉胺存在時的熒光光譜Fig.6 (A)Linear calibration plot for D-PA detection using CDs-Ag+fluorescent switch;(B)Fluorescence spectra of CDs-Ag+system with different concentrations of D-PA

圖7 碳點-銀離子熒光開關測定青霉胺的選擇性Fig.7 Selectivity of CDs-Ag+fluorescent switch for D-PA detection

此外，我們對比了本工作與其他金屬離子輔助識別青霉胺的方法。如表2所示，該銀離子輔助的熒光開關方法，在具有較低檢出限的同時，具有較寬的線性范圍。這證明該方法具有一定的優(yōu)勢，對青霉胺的分析方法是一個有效的補充。

表2 本工作與其他金屬離子輔助識別青霉胺方法的對比Table 2 Comparison of this work with other metal ions assisted methods for D-PA recognition

2.5 實際樣品測定

上述結果表明，該銀離子輔助的碳點熒光開關具有檢測實際樣品中青霉胺含量的能力。我們選取了健康志愿者的尿液作為測定樣品。表3記錄了測定結果，可以看出樣品的加標回收率處在97.17%～102.05%之間。該結果證明了碳點-銀離子熒光開關在實際樣品中測定青霉胺具有可靠性。

表3 尿液樣品中青霉胺含量的測定Table 3 Determination of D-PA in human urine sample

3 結論

從半胱氨酸出發(fā)，通過一步熱解法制備得到熒光碳點。銀離子能夠結合到碳點表面通過光誘導的電子轉移猝滅碳點熒光，進一步引入青霉胺后，由于青霉胺和銀離子的配位作用，銀離子離開碳點表面實現(xiàn)熒光恢復，基于此建立了熒光點亮型探針識別青霉胺，并成功應用于實際樣品測定。本方法具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，并且銀離子是首次用于構建基于碳點的熒光開關識別青霉胺，對青霉胺的熒光分析是一個有效的補充。