王 玉，劉采云

（1.厚德食品股份有限公司上海第一分公司，上海 201100；2.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海 200082）

疲勞是持久或過度勞累后造成的身體不適及工作效率減退的現(xiàn)象[1]。長期以來，眾多學者期望能尋找到一種安全、有效、無毒副作用的方法來有效延緩疲勞的發(fā)生和加速疲勞的消除[2]。

雞蛋清蛋白質(zhì)氨基酸模式與人體最接近，生物利用率高，被認為是蛋白質(zhì)的理想來源。蛋清蛋白經(jīng)過一種或多種酶水解后形成具有生物活性的肽段，可在食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)方面發(fā)揮極大作用[3-4]。目前，發(fā)現(xiàn)的雞蛋中的生物活性肽包括降血壓肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽和促進腦部健康肽等[5-9]。

斑馬魚是一種新型模式脊椎動物，具有繁殖能力強、生殖周期短、胚胎透明、能在顯微鏡下進行實時觀察等特點。其基因與人類基因有著87%的相似性，它們的編碼蛋白結構相似而且在生物體內(nèi)發(fā)揮類似的功能，被美國食品藥品監(jiān)督管理局列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應用于生命科學研究[10-11]。

利用行為分析儀測定斑馬魚的運動總距離，以統(tǒng)計學意義確定了HEpep 對亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚運動的改善作用，旨在探索雞蛋清水解物的新的應用方向。

1 材料與方法

1.1 原料

斑馬魚（野生AB 系）；HEpep，厚德食品股份有限公司提供；亞硫酸鈉、NaOH 溶液、檸檬酸，阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；中華跌打丸，廣西梧州制藥（集團） 股份有限公司提供；乳酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 主要儀器設備

V3 行為分析儀，ViewPoint Life Sciences 產(chǎn)品；SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；Waters 1525 型高效液相色譜儀、L-8900 型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 HEpep 的制備工藝

HEpep 制備工藝：蛋清蛋白→酶解→酶解液→膜分離→濃縮噴霧干燥→蛋清蛋白肽。

1.3.2 HEpep 分子量大小的測定

HEpep 分子量大小的測定采用Waters 1525 高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測器和Empower 工作站GPC 軟件），色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動相為乙腈/ 水/ 三氟乙酸= 45/55/0.1（V/V/V），檢測波長為220 nm，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.3.3 HEpep 氨基酸含量的測定

氨基酸含量選用日立L-8900 全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.4 斑馬魚仔魚的準備

斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導率為480～510 μS/cm，pH 值為6.9～7.2，硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3），試驗動物使用許可證號為：SYXK（浙） 2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC 認證的要求。

野生型AB 品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后4 d（4 dpf），共180 尾，每試驗組為30 尾，用于確定HEpep 抗疲勞作用的最大檢測濃度（MTC）。野生型AB 品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后4 d（4 dpf），共180 尾，每試驗組為30 尾，用于HEpep 抗疲勞作用評價。

1.3.5 確定HEpep 的最大檢測濃度（MTC）

隨機選取180 尾受精后4 d（4 dpf） 野生型AB品系斑馬魚，每孔（試驗組） 均處理30 尾斑馬魚，分別水溶給予HEpep 質(zhì)量濃度250，500，1 000，2 000，4 000 μg/mL，同時設置正常對照組（即養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每孔（試驗組） 容量為5 mL，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d。試驗結束后，觀察記錄斑馬魚的死亡數(shù)量和毒性情況，確定HEpep 對斑馬魚的最大檢測濃度（MTC）。

1.3.6 HEpep 對斑馬魚運動的影響

隨機選取180 尾受精后4 d（4 dpf） 野生型AB 品系斑馬魚，每孔（試驗組） 均處理30 尾斑馬魚，分別水溶給予HEpep 質(zhì)量濃度111，333，1 000 μg/mL，陽性對照藥中華跌打丸1 mg/mL，同時設置正常對照組（即養(yǎng)魚用水處理斑馬魚） 和模型對照組，每孔（試驗組） 容量為5 mL。28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d后，除正常對照組外，其余試驗組均用8 mg/mL 亞硫酸鈉處理5 d 斑馬魚20 min，以誘發(fā)斑馬魚疲勞模型。

HEpep 和亞硫酸鈉共同處理斑馬魚20 min 后，每個試驗組隨機選取10 尾斑馬魚，利用行為分析儀，測定斑馬魚的運動總距離（S），以統(tǒng)計學意義評價HEpep 對亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚運動的改善作用。

HEpep 對斑馬魚運動能力改善作用計算公式如下：

式中：S——供試品組；

SM——模型對照組；

SC——正常對照組

1.3.7 運動后斑馬魚乳酸含量測定[12]

乳酸測試盒按步驟加樣后，采可見光分光光度計測其吸光值（波長530 nm），制作乳酸含量的標準曲線。在低溫環(huán)境中，將運動后的模型斑馬魚、陽性對照組（用中華跌打丸處理） 和HEpep 3 個質(zhì)量濃度（111，333，1 000 μg/mL） 處理后的斑馬魚用10倍生理鹽水制成勻漿液，離心后取上清液稀釋5 倍后測其吸光值（波長530 nm），通過標準曲線計算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度（mmol/L），換算后即得斑馬魚體內(nèi)乳酸濃度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

用方差分析和Dunnett's T- 檢驗進行統(tǒng)計學分析，p＜0.05 表明具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 HEpep 的分子量

HEpep 的凝膠滲透色譜圖見圖1，HEpep 的凝膠滲透色譜分析結果見表1。

圖1 HEpep 的凝膠滲透色譜圖

表1 HEpep 的凝膠滲透色譜分析結果

從表1 可知，分子量為668，303 的肽段含量最大，分別占25.22%，48.05%。

2.2 HEpep 的氨基酸含量檢測結果

HEpep 的氨基酸含量檢測結果見表2。

對雞蛋清水解物HEpep 的氨基酸含量進行分析可以看出，HEpep 中必需氨基酸占氨基酸總量的36%，而且必需氨基酸是非必需氨基酸的0.56 倍。根據(jù)FAO/WHO，理想蛋白模式中，必需氨基酸含量應該占氨基酸總量的40%左右，且必需氨基酸含量應是非必需氨基酸含量的0.60 倍。由此可以得出HEpep的氨基酸模式非常接近FAO/WHO 對理想蛋白質(zhì)的規(guī)定，而且HEpep 中氨基酸含量高達127.68 mg/g，說明HEpep 可以作為一種理想的蛋白質(zhì)來源。另外，HEpep 中支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸）的含量高達15.93 mg/g。

表2 HEpep 的氨基酸含量檢測結果

2.3 HEpep 質(zhì)量濃度對斑馬魚死亡率的影響

HEpep 處理后斑馬魚“質(zhì)量濃度-死亡率”試驗結果（n=30） 見表3。

表3 HEpep 處理后斑馬魚“質(zhì)量濃度-死亡率”試驗結果（n=30）

表3 表明了HEpep 處理后斑馬魚“質(zhì)量濃度-死亡率”的試驗結果。由表3 可知，HEpep 在250～1 000 μg/mL 下，未引起斑馬魚死亡，也未見其他明顯的毒性表型；然而在2 000 和4 000 μg/mL 下，分別誘發(fā)11/30 和30/30 尾斑馬魚死亡，死亡率分別為36.7%和100%，故確定HEpep 對斑馬魚抗疲勞作用的最大檢測質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL，因此抗疲勞作用正式試驗質(zhì)量濃度設置為111，333，1 000 μg/mL。

2.4 HEpep 的抗疲勞作用評價

亞硫酸鈉可以與水中的溶解氧發(fā)生反應，造成環(huán)境中缺氧，斑馬魚在缺氧環(huán)境中造成疲勞，因此常用于疲勞造模[13]。運動耐力試驗是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標，是機體運動過程中物質(zhì)代謝和能量代謝的綜合體現(xiàn)[14]。

HEpep 對疲勞斑馬魚運動能力的影響（n=10）見表4，HEpep 對疲勞斑馬魚體內(nèi)乳酸含量的影響(p＜0.05)（n=10） 圖2。

表4 HEpep 對疲勞斑馬魚運動能力的影響（n=10）

圖2 HEpep 對疲勞斑馬魚體內(nèi)乳酸含量的影響(p＜0.05)（n=10）

陽性對照藥中華跌打丸由金不換、半邊蓮等數(shù)十種中草藥組成，具有消腫止痛、舒筋活絡、止血生肌、活血驅(qū)風的功效[15]。從表4 可知，模型對照組斑馬魚總運動距離（2 622 mm） 與正常對照組（6 505 mm） 比較，說明疲勞斑馬魚模型構建成功；陽性對照藥中華跌打丸組（1 mg/mL） 斑馬魚總運動距離為7 097 mm，與模型對照組比較其運動改善作用為115.2%。根據(jù)圖2 所示，中華跌打丸組斑馬魚運動后體內(nèi)乳酸含量最低（0.003 mmol/g），與模型對照組比較（乳酸含量0.092 mmol/g），乳酸含量降低97%，說明中華跌打丸可顯著改善亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚運動能力，降低體內(nèi)乳酸含量。此結果與高華等人[15]的研究結果一致，中華跌打丸能明顯延長小鼠負重游泳時間，降低運動后血清尿素氮的含量，加快運動后血清乳酸的消除速率，對緩解機體運動中的疲勞感有積極的作用[16]。

HEpep 質(zhì)量濃度111，333，1 000 μg/mL 組斑馬魚總運動距離分別為5 439，3 280，2 697 mm，與模型對照組（2 622 mm） 比較，其運動改善作用分別為72.5%，16.9%，1.9%，HEpep 處理后斑馬魚運動后體內(nèi)乳酸含量分別為0.034，0.075，0.087 mmol/g（見圖2），與模型對照組比較，乳酸含量分別降低63.2%，18.8%，5.1%。說明在試驗質(zhì)量濃度條件下，HEpep 對亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，而且當HEpep 質(zhì)量濃度為111 μg/mL時，該作用最明顯，乳酸含量降低率也最大。當HEpep質(zhì)量濃度大于111 μg/mL 時（333 和1 000 μg/mL），對疲勞斑馬魚運動改善作用呈現(xiàn)減弱趨勢，運動后斑馬魚體內(nèi)乳酸累積量也呈現(xiàn)上升趨勢。該結果提示HEpep 作為疲勞改善劑使用時，適宜質(zhì)量濃度范圍為0～111 μg/mL，并非劑量越大越好。根據(jù)HEpep的GPC 分子量分析結果顯示，分子量668，303 的肽段占比最大，分別占25%，48%。研究發(fā)現(xiàn)，小分子肽在人體不需消化可直接吸收，能直接參與蛋白質(zhì)的合成[17]。蛋清蛋白通過酶解作用也可產(chǎn)生具備抗氧化活性的氨基酸，包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸等[18]，可清除體內(nèi)超氧陰離子和羥基自由基（·OH），維持機體氧化還原平衡[19]，降低疲勞感。根據(jù)表2 結果可知，HEpep 中具有抗疲勞功效的支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸） 含量高達15.93 mg/g，可能是HEpep 對亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用的原因。

3 結論

雞蛋清水解物HEpep 中支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+ 纈氨酸） 含量豐富，高達15.93 mg/g。對于亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚，在111，333，1 000 μg/mL 的質(zhì)量濃度條件下，其運動改善作用分別為72.5%，16.9%，1.9%，乳酸含量分別降低63.2%，18.8%，5.1%。HEpep 對亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，HEpep 作為疲勞改善劑使用時，適宜質(zhì)量濃度范圍為0～111 μg/mL。