金剛藤對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的影響

周芬敏，文一惠，凌江紅，3，郭錦榮，陳珺明

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院，上海 200021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

金剛藤為百合科植物菝葜Smilax chinaL.的塊莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效，臨床上常用于治療盆腔炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腰腿痛等疾病。近年來，藥理學(xué)研究證實(shí)金剛藤具有抗多種腫瘤的作用［1-2］。本課題組前期研究表明，金剛藤能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌的作用［3］。自噬是細(xì)胞為維持自身穩(wěn)態(tài)的一種通過細(xì)胞內(nèi)溶酶體途徑降解的過程，通過自身降解受損的細(xì)胞器或錯誤折疊蛋白，為細(xì)胞提供能量。自噬與腫瘤細(xì)胞關(guān)系密切，適當(dāng)自噬能夠為腫瘤細(xì)胞提高能量，促進(jìn)細(xì)胞生長及增殖，而過度自噬則會啟動細(xì)胞自噬性死亡［4］，微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）參與了自噬體的形成［5］。本研究通過觀察金剛藤對自噬相關(guān)蛋白LC3 的影響，初步探討金剛藤對肝癌細(xì)胞自噬的影響，為金剛藤的抗腫瘤機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗材料

1.1 藥材 金剛藤（產(chǎn)自廣西，批號：161201），由桂林鼎康中藥飲片有限公司提供。

1.2 動物及細(xì)胞株 SPF級SD雄性大鼠16只，鼠齡8～10 W，體質(zhì)量160～200 g，購自上海十指生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（滬）2018-0004。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗，喂養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食及飲水。人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由上海中科院細(xì)胞庫提供。

1.3 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗混合液（美國GIBCO 公司）；胎牛血清（美國GIBCO 公司）；Apoptosis Detection Kit（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.4 儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；高速低溫離心機(jī)（美國Sigma 公司）；蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 金剛藤水煎液的制備 取金剛藤飲片200 g，加入水至高出藥面2～3 cm，浸泡2 h，武火煮沸后，改用文火煎煮30 min，冷卻后，過濾取藥液，濾渣如上法再煎2 次，混合3 次藥液，濃縮成100 ml，即藥物濃度為2 g/ml，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 含藥血清的制備 將16 只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、金剛藤低劑量組（JGT-L 組）、金剛藤中劑量組（JGT-M 組）和金剛藤高劑量組（JGT-H 組），每組4只。金剛藤低、中、高劑量組大鼠分別以金剛藤水煎液 0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml 灌胃，每次 4 ml；空白對照組大鼠每天給予等量生理鹽水灌胃；各組均每天灌胃2 次，間隔 12 h，連續(xù)給藥 3 d。末次給藥 1 h 后，大鼠予CO2窒息處死，心臟取血，靜置，離心15 min取血清，過濾、滅活除菌，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇存活下來的SMMC-7721細(xì)胞置于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞接種106個/板，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%雙抗，于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d 換液傳代1 次，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗。

2.4 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖的抑制率 取對數(shù)生長期SMMC-7721 細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105個/ml，加入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 0.1 ml，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁約70%～80%時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，按上述實(shí)驗分組方法分別加入相應(yīng)含藥血清，空白對照組及金剛藤低、中、高劑量組分別給予空白血清、金剛藤含藥血清（0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml）0.2 ml，培養(yǎng)48 h后行CCK-8實(shí)驗，每組重復(fù) 6 個副孔，每孔分別加入 10 μl 的 CCK-8 溶液，繼續(xù)再置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔的光密度值（OD 值）。按以下公式計算細(xì)胞增殖抑制率（IR）：IR=（1－實(shí)驗組OD值均數(shù)/對照組OD值均數(shù)）×100%。

2.5 Western Blot檢測各組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá) 金剛藤含藥血清培養(yǎng)SMMC-7721 細(xì)胞48 h，PBS 漂洗，分別提取細(xì)胞總蛋白定量后，取20 μg的等量蛋白樣品，12%SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，加入一抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ（均1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入羊抗鼠IgG（1∶50 000）37 ℃孵育2 h，PBST 洗膜3 次，每次 5 min。采用Oddsey 掃描儀掃描保存圖片，用Image J軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值計算。以目的條帶（LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ）與內(nèi)參條帶（β-actin）的總灰度值之比為標(biāo)準(zhǔn)評價結(jié)果，即目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 （±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05；與JGT-L 組比較，②P＜0.05；與JGT-M組比較，③P＜0.05

組 別空白對照組JGT-L組JGT-M組JGT-H組n 4 4 4 4 OD 值2.139±0.126 1.611±0.078 0.737±0.062 0.184±0.054抑制率（%）0±5.887 24.667±3.633①65.523±2.900①②91.381±2.539①②③

表1結(jié)果顯示，與空白對照組比較，金剛藤各劑量組對人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株的抑制率均顯著增加（均P＜0.05）；與JGT-L 組比較，JGT-M、JGT-H 組對人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株的抑制率均顯著增加（均P＜0.05）；與 JGT-M 組 比 較 ，JGT-H 組 對 人 肝 癌SMMC-7721 細(xì)胞株的抑制率顯著增加（P＜0.05）。顯示金剛藤高劑量組抑制率最高，抑制作用與濃度呈正相關(guān)。

3.2 各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對表達(dá)量比較 與空白對照組比較，金剛藤各劑量組LC3-Ⅰ蛋白相對表達(dá)量無顯著性差異，金剛藤各劑量組LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量均顯著升高（均P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著升高（均P＜0.05）。結(jié)果見表2及圖1。

表2 各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對表達(dá)量比較 （±s）

表2 各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05

組 別空白對照組JGT-L組JGT-M組JGT-H組n 4 4 4 4 LC3-Ⅰ0.913±0.055 0.970±0.095 0.897±0.051 0.957±0.047 LC3-Ⅱ0.900±0.148 1.360±0.043①1.217±0.050①1.317±0.091①LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ0.990±0.096 1.267±0.150①1.230±0.026①1.283±0.148①

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)

4 討 論

多項研究發(fā)現(xiàn)金剛藤可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。于麗秀等［6］研究表明，菝葜提取物可以抑制A2780、HO8910PM 卵巢癌細(xì)胞的增殖，抑制作用呈劑量及時間依賴性。HU 等［2］研究表明，金剛藤可以促進(jìn)卵巢癌A2780 細(xì)胞對順鉑和阿霉素的化學(xué)敏感性，提示金剛藤抗卵巢癌細(xì)胞不僅與其抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖有關(guān)，還與其降低卵巢癌細(xì)胞對順鉑和阿霉素的耐藥性有關(guān)。吳先闖等［7］通過體外研究發(fā)現(xiàn)，金剛藤乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位能夠抑制肝癌細(xì)胞H22、HepG-2、BEL-7402 的增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。本課題組前期觀察到金剛藤具有較好的抑制肝癌細(xì)胞生長及增殖的作用［8］。本實(shí)驗選用CCK-8 法檢測金剛藤對SMMC-7721 細(xì)胞增殖抑制率的影響，結(jié)果表明，金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且其抑制作用隨著金剛藤濃度的升高而增大，具有濃度依賴性，金剛藤高劑量組對細(xì)胞的作用最強(qiáng)，表明了金剛藤具有抗肝癌作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金剛藤抗腫瘤作用機(jī)制可能與增強(qiáng)免疫功能［9］、抑制腫瘤細(xì)胞增殖［6-7］、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1、10］、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［11］等作用有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金剛藤具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721 凋亡的作用，可能與下調(diào)POLD1 基因的表達(dá)有關(guān)［3］。細(xì)胞自噬是一個涉及多個自噬相關(guān)蛋白相互作用的動態(tài)過程，細(xì)胞在自噬形成的過程中產(chǎn)生雙層膜構(gòu)造，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)包裹起來，形成細(xì)胞自噬體，進(jìn)而與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體，分解其包裹的物質(zhì)，降解自身受損的結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的正常生長，并且能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的生長起著保護(hù)的作用［12］；另一方面，過度自噬則可以引起細(xì)胞自噬性死亡，亦稱Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡，能夠主動誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［13］。研究表明，枸杞多糖誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬，對肝癌細(xì)胞的生長起著保護(hù)作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，在和自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞的凋亡率增高，表明枸杞多糖誘導(dǎo)的是保護(hù)性自噬［14］。南蛇藤素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，細(xì)胞增殖活力降低，但和自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，表明南蛇藤素誘導(dǎo)的是殺傷性自噬［15］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖［16］。這些研究說明自噬在腫瘤病理機(jī)制中的復(fù)雜性。

自噬相關(guān)蛋白LC3 參與了自噬的過程，LC3 一般以可溶性胞漿型LC3-Ⅰ的形式存在，細(xì)胞自噬時，LC3-Ⅰ酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄缘腖C3-Ⅱ［17］，LC3-Ⅱ是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，能反映細(xì)胞自噬體的數(shù)量，而LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值可以評價自噬體的形成［5］。自噬體的數(shù)量與其生成及降解的多少有關(guān)［18］。韓志偉等［19］研究發(fā)現(xiàn)，健脾消積方（太子參、黃芪、白花蛇舌草等藥物組成）能夠抑制SMMC-7721 細(xì)胞增殖，并且能夠上調(diào)LC3-Ⅱ和p62 的表達(dá)，提示其抗SMMC-7721 細(xì)胞可能是使自噬體的生成增多，抑制自噬體的溶解，細(xì)胞內(nèi)大量堆積自噬體而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。龔永昌等［20］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制人胃癌AGS 細(xì)胞的增殖，上調(diào)LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62 的表達(dá)，姜黃素聯(lián)合自噬抑制劑氯喹進(jìn)一步增強(qiáng)LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62 的表達(dá)，提示姜黃素抗AGS 細(xì)胞可能與其抑制細(xì)胞自噬流、自噬體降解，使自噬體大量堆積促進(jìn)細(xì)胞死亡有關(guān)。本實(shí)驗中，經(jīng)不同濃度的金剛藤含藥血清作用 48 h 后，通過 Western Blot 法觀察 LC3 的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金剛藤可使SMMC-7721 細(xì)胞中LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，LC3-Ⅰ表達(dá)未見減少，并未出現(xiàn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變，提示自噬體數(shù)量增多，并且自噬體的增多可能與其降解減少有關(guān)。綜合上述實(shí)驗結(jié)果，我們認(rèn)為金剛藤可抑制人肝癌細(xì)胞增殖，可能與其抑制肝癌細(xì)胞自噬體降解有關(guān)。