史紫娟，林碧珊，曾杉，陳錦霞

國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

野菊花為菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序[1]314-315，秋、冬兩季花初開放時采摘，曬干或蒸后曬干。其味苦，性微寒，歸肝、心經(jīng)，具有清熱解毒、瀉火平肝之功效[2]，用于治療癰腫瘡毒、濕疹、宮頸炎、前列腺炎、肛竇炎、高血壓等[3]。菊花為菊科植物菊C.morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等[1]310-311。

菊花為野菊花的易混淆品種，目前有野菊花或菊花指紋圖譜的研究報道[4-8]。但未見采用特征圖譜對二者進(jìn)行區(qū)別的研究。本研究從整體上對野菊花藥材和菊花藥材進(jìn)行鑒別研究，為藥材應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

對照品綠原酸(批號：110753-201716，純度：99.3%)、木犀草苷(批號：111720-201408，純度：94.9%)、蒙花苷(批號：11528-201710，純度：96.6%)均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品4-咖啡?？鼘幩?批號：DST170210-035，純度：99.79%)、3，5-二咖啡酰奎寧酸(批號：DST180110-036，純度：99.5%)、4，5-二咖啡?？鼘幩?批號：DST170210-038，純度：99.47%)均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；乙腈、磷酸為色譜純；乙醇為分析純；水為自制超純水。

野菊花、菊花藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定，為菊科植物野菊C.indicumL.的干燥頭狀花序及菊科植物菊C.morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，藥材來源分別見表1～2。

表1 野菊花藥材來源

表2 菊花藥材來源

1.2 儀器

Waters H-Class型高效液相色譜儀(PDA檢測器，四元梯度泵，美國沃特世公司)；AL104型電子天平、PL203型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；以乙腈為流動相A、0.1%磷酸水溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min,100%～85% B;5～15 min,85%～60%B;15～18 min,60%～10%B;18.1～22 min,100%B)；體積流量0.3 mL·min-1；檢測波長326 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 分別稱取綠原酸、4-咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩岷兔苫ㄜ?種對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為21.10、28.00、40.20、28.10、24.90、25.78 μg·mL-1的混合溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取野菊花和菊花藥材粉末(過三號篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn) 精密稱取野菊花和菊花藥材各0.25 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取同1份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以共有峰的相對保留時間和相對峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn) 精密平行稱取野菊花和菊花藥材各6份，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以共有峰的相對保留時間和相對峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于3.0%；表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同1份野菊花和菊花藥材供試品溶液，在相同的條件下分別在0、2、4、6、19、20、24 h測定，以共有峰的相對保留時間和相對峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測定與分析

分別取15批野菊花藥材和12批菊花藥材粉末各0.25 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，采用國家藥典委員會頒布的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對色譜圖進(jìn)行匹配，得到了野菊花藥材特征圖譜和菊花藥材特征圖譜，15批野菊花藥材和12批菊花藥材的UPLC特征圖譜見圖1～2。同時進(jìn)行了相似度分析，結(jié)果見表3。

通過對比保留時間和紫外吸收的方法指認(rèn)了6個共有峰，分別為綠原酸(1號峰)、4-咖啡?？鼘幩?2號峰)、木犀草苷(3號峰)、3，5-二咖啡?？鼘幩?4號峰)、4，5-二咖啡?？鼘幩?5號峰)、蒙花苷(6號峰)，指認(rèn)結(jié)果見圖3。以蒙花苷參照物峰為S峰，計(jì)算綠原酸峰與蒙花苷峰的相對峰面積。結(jié)果見表4。

注：1～6號峰分別為15批野菊花藥材特征峰。圖1 15批野菊花藥材UPLC特征圖譜

注：1～6號峰分別為12批菊花藥材特征峰。圖2 12批菊花藥材UPLC特征圖譜

表3 野菊花藥材和菊花藥材的相似度結(jié)果

注：1～6號峰分別為綠原酸、4-咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷(S)；A.對照品；B.野菊花藥材；C.菊花藥材。圖3 對照品色譜圖、野菊花藥材特征圖譜及菊花藥材特征圖譜

表4 多批野菊花藥材和菊花藥材特征圖譜相對峰面積

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中對提取溶劑、提取方式和提取時間分別進(jìn)行了考察，采用甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、60%乙醇、水為提取溶劑，結(jié)果70%甲醇和60%乙醇對野菊花和菊花藥材主要成分的分離效果均較好，由于60%乙醇比70%甲醇更加安全、經(jīng)濟(jì)，最終選擇60%乙醇為提取溶劑。通過考察超聲和回流2種提取溶劑，結(jié)果回流提取的效率優(yōu)于超聲提取，因此選用回流作為提取方式。對提取時間進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)提取時間對色譜峰影響不大，為節(jié)省時間，選擇回流提取30 min作為樣品的提取方法。

本研究以蒙花苷為參照峰確定了野菊花藥材和菊花藥材的6個共有峰，計(jì)算綠原酸峰與蒙花苷峰的相對峰面積，發(fā)現(xiàn)15批野菊花藥材的相對峰面積在0.152～0.265，均小于1.0，而12批菊花藥材的相對峰面積均大于1.0，根據(jù)特征圖譜中綠原酸峰與蒙花苷峰的相對峰面積可快速鑒別野菊花藥材和菊花藥材。