劉天波 ，蔡海林，滕凱，曾維愛，毛輝，魏潤潔 ，周志成，周向平，戴良英 ，唐前君*

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128；

2 植

物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128；

3 長沙市煙草公司，長沙 410010；

4 湘西州煙草公司，吉首 416002；

5 湖南省煙草科學(xué)研究所，長沙 410004；

6 永州市煙草公司，永州 425000

由馬鈴薯Y 病毒Potato virus Y（PVY）引起的病毒病是煙草上的重要病害，在全世界普遍發(fā)生，且呈日益嚴(yán)重的趨勢(shì)[1-3]。PVY 是馬鈴薯Y 病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus）的典型成員，為單鏈正義RNA 病毒，外面包被外殼蛋白（coat protein，CP）。CP 除對(duì)病毒起保護(hù)作用外，還與病毒組裝、蚜蟲傳毒、調(diào)控病毒RNA 復(fù)制等有關(guān)[4-5]。目前，生產(chǎn)上防治馬鈴薯Y 病毒病主要以化學(xué)防治為主[6]，防治效果不佳，也易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染?？共∑贩N的培育是防治病毒病有效的方式之一，劉勇等[7-9]通過種質(zhì)資源篩選、EMS 誘變、基因編輯技術(shù)，抗病定向改良品種云煙87 獲得抗PVY 的新品種云煙121。但育種周期較長，抗病新品種審定推廣緩慢，煙葉種植者對(duì)新品種栽培、烘烤特性難以把握。

20 世紀(jì)20—30 年代，人們發(fā)現(xiàn)感染了病毒溫和株系的植株可以抵御與其親源關(guān)系相近的強(qiáng)毒株系病毒的侵染，即交叉保護(hù)現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，交叉保護(hù)是一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS），使植株產(chǎn)生了對(duì)該病毒的抗性。VIGS 是植物抗病毒侵染的一種自然機(jī)制[10]，已被廣泛應(yīng)用于煙草、擬南芥、馬鈴薯、大豆、玉米等植物基因功能鑒定研究[11-12]。在VIGS 體系中，需要病毒載體介導(dǎo)基因沉默。常見的RNA 病毒載體有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯X 病毒（Potato virus X，PVX）、煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）等[13]。TRV 作為誘導(dǎo)基因沉默的載體是目前應(yīng)用最廣的載體之一，具有寄主范圍廣、沉默效率高、持續(xù)時(shí)間長、引起的病毒癥狀輕等優(yōu)點(diǎn)[14]，已被廣泛應(yīng)用于煙草、番茄、辣椒等多種茄科植物[15-18]。TRV 為二元RNA 病毒，Ratcliff等[19]將TRV 改造成RNA2（pTRV2）和RNA1（pBINTRA6）cDNA 的雙元表達(dá)載體，并利用TRV 載體成功使轉(zhuǎn)基因煙草的綠色熒光蛋白基因沉默。以TRV 為載體的VIGS 技術(shù)可以使攜帶目標(biāo)基因片段的TRV 侵染植物，導(dǎo)致后續(xù)侵入病毒的靶向同源基因降解，達(dá)到抑制靶病毒侵染的目的，為病毒病防治提供利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，本文介紹了構(gòu)建靶向PVY CP基因片段的煙草脆裂病毒TRV 載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后處理煙苗，人工接種PVY，通過RT-qPCR 檢測(cè)、表型觀察和小區(qū)試驗(yàn)評(píng)價(jià)VIGS 處理煙株的效果，旨在建立TRV 介導(dǎo)的VIGS 體系防治PVY，為PVY 的防治提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：煙草品種為‘K326’，其種子由湖南省煙草公司長沙市公司提供。

菌株和病毒：根癌農(nóng)桿菌GV3101、TRV 載體pTRV2（GenBank 登 錄 號(hào)：NC-003811.1） 和pBINTRA6（pTRV1）均由湖南省植物保護(hù)研究所張德詠研究員饋贈(zèng)。所用PVY 為脈壞死株系（PVYN），從湖南煙區(qū)煙草上分離保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已測(cè)定的P V YN（G e n B a n k 登錄號(hào)：HQ631374）序列，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

表1 本研究使用的引物序列1）Tab.1 Primers used in this study

1.3 VIGS 載體的構(gòu)建

利用生工生物工程 （上海）股份有限公司的UNIQ-10 柱式TRIzol 總RNA 抽提試劑盒提取感染PVY 的‘K326’煙株葉片總RNA，具體操作方法依據(jù)產(chǎn)品說明書。參照TransGen Biotech 公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書反轉(zhuǎn)成cDNA。以獲得的cDNA 為模板，按照表1 中相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：10× Top Taq Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 1.6 μL，20 μmol/L CPF/CPR 引物各0.8 μL，10 μmol/L cDNA 模板1 μL，TaqDNA 聚合酶0.4 μL，加ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收目的片段。將回收片段與載體T1 Cloning Vector（TransGen Biotech 公司）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TransT1 Chemically Competent Cell（TransGen Biotech 公司）。提取質(zhì)粒T-CP 和pTRV2 質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行BamHI/KpnI 雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用CPF/CPR 引物篩選陽性克隆，提取pTRV2-CP 質(zhì)粒，用BamHI/KpnI 酶切驗(yàn)證，篩選獲得的陽性克隆送上海生物工程有限公司測(cè)序。pTRV1 和pTRV2-CP 的具體構(gòu)建參照Chung 等[18]的方法（構(gòu)建方法見圖1）。

圖1 表達(dá)載體pTRV2-CP 的構(gòu)建Fig. 1 The construction of expression vector of pTRV2-CP

1.4 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化

參照Ratcliff等[19]方法進(jìn)行重組表達(dá)載體pTRV2-CP 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將菌液均勻涂抹在YEP （含有濃度為50 mg/mL 利福平和卡那霉素）固體培養(yǎng)基上，28℃下倒置培養(yǎng)2 d；挑取單菌落進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，1%凝膠電泳、回收、測(cè)序。

1.5 VIGS 表達(dá)載體侵染率的測(cè)定

將pTRV2-CP-GV3101、pTRV1-GV3101 和pTRV2-GV3101 分 別 于YEP 培 養(yǎng) 基 中30 ℃，180 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵原液，調(diào)整OD600至0.4～0.6， 然 后 將pTRV2-CP-GV3101 和pTRV1-GV3101 發(fā)酵液等比混合，制備成發(fā)酵混合液TRV::CP。在煙草出苗后40 d（4 葉1 心）在苗盤剪葉時(shí)用噴壺噴施發(fā)酵液TRV::CP 于煙草正反葉片，每株噴施0.1 mL，發(fā)酵液處理7 株，設(shè)3 株對(duì)照（YEP培養(yǎng)基處理），3 次重復(fù)，共30 株。每隔7 d 剪葉時(shí)處理1 次，共處理3 次。最后1 次剪葉3 d 后移栽，移栽后10 d 取新生長出的最頂端心葉，充分表面消毒后提取總RNA，按照表1 中相應(yīng)的引物CPF/CPR進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。

1.6 PVY 和TRV RT-qPCR 檢測(cè)

按照1.5 的方法獲得TRV::CP 處理煙苗，同時(shí)將pTRV2-GV3101 和pTRV1-GV3101 發(fā)酵液等比混合制備成發(fā)酵混合液TRV::00；發(fā)酵液濃度為OD6000.4～0.6。試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理20 株煙。處理A：噴施發(fā)酵混合液TRV::CP；處理B：噴施發(fā)酵混合液TRV::00（空載體對(duì)照）；處理C：噴施YEP 液體培養(yǎng)基 （CK）。煙苗處理后按照常規(guī)方法管理，3 d 后移栽入營養(yǎng)缽。

取-80℃冷凍保存含PVYN煙葉，按1:100 加磷酸緩沖液，搗碎過濾制備成懸浮液。上述3 個(gè)處理過的煙苗（移栽后7 d）每株選取中上部葉3 片，表面均勻撒碳化硅（600 目），毛筆蘸取懸浮液，葉面輕度摩擦接種，25℃左右溫室中正常栽培管理。接種后7 d 開始取煙株上部新生長出的最頂端心葉樣品，每隔7 d 取一次，共取5 次，充分表面消毒后，提取總RNA，參照TransGen Biotech 公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書反轉(zhuǎn)成cDNA，以煙草NtEF1 基因（GenBank登錄號(hào)AF120093.1）[20]為內(nèi)參基因?qū)Σ煌瑯悠返腸DNA 含量進(jìn)行調(diào)節(jié)，以PVYF/PVYR 引物進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增檢測(cè)沉默后處理煙株中PVY 累積量。

按照前述試驗(yàn)方法設(shè)置TRV::CP 和TRV::00 2個(gè)處理，發(fā)酵混合液最后一次處理后10 d 人工接種PVY，接種后7 d 開始取新生長出的最頂端心葉，每隔7 d 取一次，共取5 次，提取RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，以煙草NtEF1 基因?yàn)閮?nèi)參基因，應(yīng)用TRVF/TRVR 引物進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，檢測(cè)不同處理煙株中TRV 表達(dá)量。

1.7 盆栽試驗(yàn)防治PVY 效果

按照1.6 方法處理和接種PVY，溫室接種15 d后開始病情調(diào)查，每隔10 d 調(diào)查1 次，共調(diào)查3 次，病情指數(shù)調(diào)查與分級(jí)，根據(jù)《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》（GB/T 23222—2008）。按下列公式計(jì)算防治效果：

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%；

病情指數(shù)=（Σ 各級(jí)病株數(shù)×病級(jí)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)）×100；

防治效果=（對(duì)照病指-處理病指）/對(duì)照病指×100%。

1.8 田間小區(qū)試驗(yàn)防治PVY 效果

選取湖南省龍山縣毛坪鄉(xiāng)煙草試驗(yàn)基地的土壤肥力中等、排灌方便、歷年P(guān)VY 發(fā)病較重的1200 m2試驗(yàn)地進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn)，試驗(yàn)地與其他地塊隔離，覆地膜移栽，行株距1.2 m×0.5 m，田間管理參照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)規(guī)范。

按1.6 方法設(shè)3 個(gè)處理，于4 月25 日剪葉后立即噴施發(fā)酵混合液TRV::CP、TRV::00 和YEP 培養(yǎng)基處理煙苗。于5月4日移栽，田間每個(gè)處理3個(gè)重復(fù) （小區(qū)），每個(gè)小區(qū)50 m2。于5 月25 日（移栽后20 d）按1.6 方法摩擦接種PVY，6 月10 日）接種PVY 后15 d）開始病情調(diào)查，每隔10 d 調(diào)查1 次，共調(diào)查3 次，按1.7 方法調(diào)查病情和計(jì)算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 含PVY CP 基因片段VIGS 表達(dá)載體構(gòu)建

圖2 VIGS 表達(dá)載體pTRV2-CP 的酶切鑒定Fig. 2 Identification of VIGS expression vector pTRV2-CP by restriction enzyme digestion

以PVY cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增得到535 bp CP基因片段，連接到T 載體，再使用BamHI/KpnI 酶切后連接到pTRV2，獲得pTRV2-CP 表達(dá)載體。PCR檢測(cè)后提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序和BamHI/KpnI 雙酶切驗(yàn)證（圖2）。將pTRV2-CP 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)PCR 檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與CP 基因相應(yīng)片段序列完全一致。

2.2 VIGS 表達(dá)載體侵染率的測(cè)定

將含發(fā)酵混合液TRV::CP 噴施處理煙株3 次，最后1 次噴施15 d 后觀察煙株外觀性狀無異常，VIGS表達(dá)載體對(duì)煙草生長無明顯影響。為防止原處理菌液的污染，侵染率檢測(cè)取煙株上部新生長出的最頂端心葉，并充分洗凈消毒，提取RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，以CPF/CPR 為引物，RT-PCR 產(chǎn)物大小約為535 bp，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)基因片段完全一致，說明VIGS 表達(dá)載體成功導(dǎo)入煙株。PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，TRV::CP 處理煙株21 株，其中20 株檢測(cè)為陽性，1 株為陰性，侵染率達(dá)到95.24%，對(duì)照處理煙株全部為陰性（圖3）。

圖3 TRV::CP 處理煙株后pTRV2-CP PCR 檢測(cè)結(jié)果（部分）Fig. 3 pTRV2-CP PCR detection results of tobacco plant treated by TRV::CP

2.3 PVY 和TRV 定量 RT-PCR 檢測(cè)

以煙草NtEF1a 為內(nèi)參基因進(jìn)行定量RT-PCR 檢測(cè)，驗(yàn)證煙草中pTRV2-CP VIGS 載體對(duì)PVY 的沉默程度。結(jié)果顯示，人工接種PVY7 d 后，隨著時(shí)間的推移，發(fā)酵混合液TRV::00 和對(duì)照處理的PVY 含量逐漸增加，發(fā)酵混合液TRV::CP 處理的PVY 含量在接種后28 d 達(dá)到最高，隨后開始減少。接種PVY后14 d 開始，TRV::CP 處理的煙株P(guān)VY 的含量低于TRV::00 和對(duì)照處理的煙株，在接種PVY 后35 d，與TRV::00 相比，TRV::CP 處理的煙株P(guān)VY 累積量相對(duì)減少了72.8%（圖4）。

圖4 接種PVY 后不同時(shí)間煙草中的PVY 含量Fig. 4 PVY cumulative quantity in tobacco at different time after PVY inoculation

RT-qPCR 檢測(cè)分析pTRV2-CP VIGS 載體在煙草中不同時(shí)期表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，隨著處理的時(shí)間推移，TRV 累積量上下波動(dòng)，TRV::CP 處理在24 d 時(shí)最高，在31 d 時(shí)降至最低，然后逐漸上調(diào)；TRV::00處理在17 d時(shí)最高，在38 d時(shí)最低，然后上調(diào)?？傮w來看，VIGS 表達(dá)載體45 d 內(nèi)能有效表達(dá)（圖5）。

圖5 表達(dá)載體處理不同時(shí)間煙草中的TRV 含量Fig. 5 TRV cumulative quantity in tobacco at different time after treated by fermentation broth

2.4 表型觀察

在接種PVY 后15 d，發(fā)酵混合液TRV::00 處理煙株新葉出現(xiàn)脈明癥狀，逐漸可見輕微花葉，30 d 后葉片枯黃萎蔫，葉脈變?yōu)樯钭厣?5 d 后下部葉片枯黃、葉脈壞死；發(fā)酵混合液TRV::CP 處理煙株有明顯脈明，上部葉有花葉癥狀，但葉脈不出現(xiàn)壞死（圖6）。

圖6 VIGS 表達(dá)載體處理30 天后煙草表型觀察Fig. 6 Symptoms of tobacco plant treated by VIGS expression vector fermentation broth after PVY inoculation for 30d

2.5 VIGS 表達(dá)載體防治PVY 效果

在溫室接種PVY 15 d 后開始病情調(diào)查，結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間延長，噴施發(fā)酵混合液TRV::CP、發(fā)酵混合液TRV::00 和對(duì)照（CK）的3 個(gè)處理發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸升高，發(fā)酵混合液TRV::00 和對(duì)照（CK）處理發(fā)病較重，最高發(fā)病率達(dá)到100%，發(fā)酵混合液TRV::CP 相比TRV::00 和對(duì)照（CK）處理煙株發(fā)病率和病情指數(shù)顯著較低，對(duì)PVY 的防效最高為85.12% （表2）。

2.6 VIGS 表達(dá)載體田間防治PVY 效果

田間病情調(diào)查結(jié)果表明，自第一次調(diào)查開始，發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸升高，第三次調(diào)查時(shí)達(dá)到最高。噴施發(fā)酵混合液TRV::CP、TRV::00 和對(duì)照小區(qū)發(fā)病率分別為22.36%、86.67%和88.33%，發(fā)酵混合液TRV::CP 處理較TRV::00 和對(duì)照處理發(fā)病率和病情指數(shù)明顯較低，發(fā)酵混合液TRV::CP 對(duì)PVY 田間小區(qū)防治效果達(dá)到73.08%（圖7 和表3）。

3 討論

培育抗性品種及采用基因克隆技術(shù)進(jìn)行品種改良是防治PVY 病毒病有效方式之一。劉勇等[21-22]利用母本來源的單倍體技術(shù)獲得抗PVY 的煙草株系，從煙草EMS 突變體庫中篩選抗PVY 新資源。王貴等[23]進(jìn)行了煙草PVY 抗性的遺傳分析與分子標(biāo)記篩選，郭興啟等[24]克隆了PVYN的CP 基因，獲得7 株對(duì)PVYN高抗的轉(zhuǎn)基因煙草，江彤等[24]利用dsRNA介導(dǎo)的抗病性獲得抗PVY 的轉(zhuǎn)基因煙草。近期研究者們基于煙草行業(yè)“基因組計(jì)劃”，在克隆抗PVY基因、挖掘創(chuàng)制優(yōu)異新種質(zhì)和定向改良云煙87 品種PVY 抗性等方面取得了較好的進(jìn)展，獲得了多個(gè)抗PVY 新品種（系）。以上研究對(duì)防治PVY 提供了有效途徑，也為本研究提供了較好的借鑒，但培育抗性品種一般需要5～8 年時(shí)間，煙草種植者掌握這些新品種栽培、烘烤特性還需要較長時(shí)間，新品種風(fēng)格特征和感官質(zhì)量如何滿足工業(yè)企業(yè)原料配方需求也是一個(gè)難題，新品種應(yīng)用到煙葉生產(chǎn)中仍是一個(gè)漫長的過程。本研究建立的防控?zé)煵軵VY 病毒病的VIGS 體系，周期短、成本低、操作簡便，對(duì)煙草馬鈴薯Y 病毒病有較好的防治作用，是一種具有較好應(yīng)用前景防治PVY 的方法。

表2 發(fā)酵混合液TRV::CP 處理對(duì)PVY 的防效Tab. 2 Control effect of fermentation broth TRV::CP

表3 VIGS 表達(dá)載體田間防治PVY 的效果Tab. 3 Control effect of fermentation broth of VIGS expression vector in field

圖7 VIGS 表達(dá)載體田間防治PVY 的效果(接種PVY 后45 d)Fig. 7 Control effect of fermentation broth of VIGS expression vector in field (45 d after PVY inoculation)

目前，應(yīng)用于VIGS 的病毒載體達(dá)到40 種以上[26]，相比TMV、PVX 等其他病毒載體，攜帶目標(biāo)基因的TRV 衍生載體可以穩(wěn)定迅速地侵染植物，且不產(chǎn)生TRV 病毒癥狀，已被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯、大豆、小麥等植物VIGS 病毒載體構(gòu)建[27]。VIGS 有效的沉默期是該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵影響因素，有效的沉默期一般為30 d 左右[28-29]，本研究45 d 左右不同處理煙株中TRV 的含量仍舊能夠檢測(cè)出，表明構(gòu)建的VIGS 體系能夠較長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)。采用低溫和低濕的方法可適當(dāng)延長基因沉默的時(shí)間[30]，在合適的條件下，VIGS 的作用能夠持續(xù)幾年甚至一直持續(xù)到植物死亡[32]。不同株齡的植株對(duì)農(nóng)桿菌具有不同的敏感性。株齡過低，植株對(duì)農(nóng)桿菌的抵抗力弱，操作難度大；株齡過高，植株對(duì)農(nóng)桿菌敏感性低[32]。因此，適宜的接種時(shí)期對(duì)侵染效果有重要影響。本研究在剪葉時(shí)噴施農(nóng)桿菌發(fā)酵液，此時(shí)煙葉幼嫩，且剪葉造成傷口利于侵染，因此可以獲得較理想的沉默效率。生產(chǎn)上通常在煙苗4-5 葉期進(jìn)行剪葉以促進(jìn)生長平衡和生根，這與VIGS 技術(shù)的應(yīng)用相契合，也為技術(shù)推廣提供了便利。農(nóng)桿菌菌體不易保存，操作環(huán)境復(fù)雜，貨架期短，是VIGS 技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中的主要瓶頸，建立并優(yōu)化發(fā)酵技術(shù)和工藝，是今后努力的方向。

4 結(jié)論

建立的VIGS 體系能夠有效沉默外源侵入的PVY CP 基因的表達(dá)，對(duì)煙草的侵染效率達(dá)到95.24%，沉默有效期達(dá)到45 d，對(duì)PVY 有良好的防治效果，溫室盆栽和田間小區(qū)試驗(yàn)對(duì)PVY 防治效果分別為85.12%和73.08%。本研究結(jié)果為PVY 的防治提供了新的思路和方法，具有較好的應(yīng)用前景。