黃 倩，唐漢程，郝新迪，許夢(mèng)男，劉超杰，范雙喜，韓瑩琰

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

葉用萵苣(LactucasativeL.)菊科萵苣屬[1]，以生食為主，亦可炒食或煮制[2]，經(jīng)常食用可以補(bǔ)充蛋白、甘露醇、萵苣素等多種有機(jī)物，同時(shí)富含維生素A、維生素C及鈣、鐵、磷等多種微量元素，具有清熱利尿、擴(kuò)張血管、輔助治療高血壓等疾病的效用[3]。葉用萵苣性喜冷涼，不耐炎熱，生長(zhǎng)適宜溫度在15～20 ℃之間[4]，生長(zhǎng)溫度超過(guò)30 ℃時(shí)易先期抽薹，促使花芽分化。分化的花芽自蓮座葉中抽出從而使植株開始長(zhǎng)高，導(dǎo)致葉片數(shù)量減少[5]，大大降低產(chǎn)量，葉片苦味增加的同時(shí)導(dǎo)致品質(zhì)和商用價(jià)值的下降[6]。Diamante等[7]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)葉用萵苣進(jìn)行降溫處理能抑制抽薹；嚴(yán)妍[8]得出夜溫15 ℃有利于葉用萵苣口感和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的提高并且延遲抽薹。作物耐高溫抽薹的研究主要集中在“低溫春化型蔬菜”，對(duì)于不同溫度處理下葉用萵苣前期高溫抽薹的研究鮮見報(bào)道。本研究對(duì)葉用萵苣不同溫度處理下形態(tài)及莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)變化進(jìn)行分析，確定葉用萵苣高溫處理下抽薹時(shí)間。

石蠟切片技術(shù)是現(xiàn)今進(jìn)行組織解剖學(xué)研究中運(yùn)用最廣泛的試驗(yàn)技術(shù)之一，也是研究植物器官及組織細(xì)胞的有效手段[9]。石蠟切片具有技術(shù)成本低、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，使其廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、植物解剖學(xué)等領(lǐng)域[10-11]。石蠟切片與掃描電鏡等儀器的結(jié)合，使植物解剖學(xué)的研究從單一的觀察微觀結(jié)構(gòu)擴(kuò)增到成分的定性分析，現(xiàn)今又到定量測(cè)量，運(yùn)用石蠟切片技術(shù)分析植物的抽薹機(jī)制，更直接揭示植物的耐受機(jī)理[12]。石蠟與植物細(xì)胞組織有很好的結(jié)合性，經(jīng)過(guò)樣本采集、固定、脫水、浸蠟、包埋等一系列操作制作出切片，組織完整、厚薄均勻及染色清晰的切片才是效果好的石蠟切片。在制片過(guò)程中每一個(gè)環(huán)節(jié)都直接影響切片的質(zhì)量，根據(jù)不同植物設(shè)定不同的固定和染色時(shí)間至關(guān)重要。在前人的不斷改進(jìn)中，石蠟切片的環(huán)節(jié)和質(zhì)量漸趨完善[13]，切片流程針對(duì)不同材料做出調(diào)整[14]，Wills等[15]、Argall等[16]對(duì)石蠟切片的透明步驟做出改進(jìn)，用histolene代替二甲苯，大大降低操作過(guò)程中二甲苯對(duì)操作人員的傷害。本試驗(yàn)運(yùn)用石蠟切片技術(shù)對(duì)葉用萵苣莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的特殊狀態(tài)進(jìn)行觀察，為葉用萵苣高溫抽薹的研究提供技術(shù)支持。

隨著全球氣候變暖，溫度逐步升高，葉用萵苣在自然狀態(tài)下的生長(zhǎng)環(huán)境堪憂。葉用萵苣高溫下極易先期抽薹的生長(zhǎng)特性，使得自然環(huán)境下種植葉用萵苣受到季節(jié)和環(huán)境溫度的限制進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的降低。明確葉用萵苣高溫脅迫下抽薹時(shí)間，觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于葉用萵苣的推廣和生產(chǎn)具有重要意義。

本試驗(yàn)旨在通過(guò)設(shè)置不同溫度的生長(zhǎng)環(huán)境，觀察葉用萵苣熱敏‘s39’的外形表觀特征，測(cè)量莖長(zhǎng)，并運(yùn)用石蠟切片技術(shù)揭示莖尖分生組織顯微結(jié)構(gòu)，分析得出‘s39’品種對(duì)高溫環(huán)境的耐受性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為葉用萵苣‘s39’，北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蔬菜優(yōu)質(zhì)安全栽培技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 材料處理

選取顆粒飽滿的新鮮種子，均勻播種在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，倒入適量水分，于22 ℃人工氣候室催芽24 h，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康幼苗，用鑷子夾入含有混合基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶2∶1)的穴盤中，在人工氣候室生長(zhǎng)，21 d定植于花盆中，緩苗9 d進(jìn)行處理。對(duì)照組：6：00至20：00為22 ℃，20：00至次日6：00為17 ℃，光照強(qiáng)度12 000 lx，光照時(shí)間16 h/d，相對(duì)濕度為60%；高溫組：6：00至20：00為35 ℃，20：00至次日6：00為25 ℃，光照與相對(duì)濕度不變，時(shí)間為9 d。每組種植20株，各組生長(zhǎng)環(huán)境保持一致。選取3、5、7、9 d植株取樣，觀察形態(tài)特征并測(cè)量莖長(zhǎng)，莖尖取下放入配制好的3.7% FAA固定液中，4 ℃保存。

1.3 表觀特征、莖長(zhǎng)測(cè)量

先分別觀察葉用萵苣植株在25 ℃和35 ℃處理下(第3天、第5天、第7天、第9天)的形態(tài)變化以及長(zhǎng)勢(shì)狀況。然后25 ℃和35 ℃處理下3、5、7、9 d植株取3株，整株取下，根部切掉，清水洗凈，用測(cè)量尺測(cè)量植株莖部，獲得數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行方差分析。

1.4 葉用萵苣莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)石蠟切片觀察

(1)固定：將植株莖尖用鑷子輕輕剝出，刀片切下，盡量切去多余組織，迅速放入3.7% FAA固定液固定24 h以上。

(2)脫水：用50%、70%、80%、95%、100%、100%乙醇對(duì)材料逐級(jí)脫水，逐級(jí)脫水時(shí)間為30、30、30、30、15、15 min。

(3)透明：將脫水后的材料放入離心管中，依次加入50%二甲苯/50%乙醇溶液、純二甲苯、純二甲苯，分別處理1.0、0.5、0.5 h。

(4)浸蠟：在最后一次處理后加入切碎的石蠟碎屑(越細(xì)越好，少量多次)至飽和，于42 ℃恒溫箱內(nèi)過(guò)夜。

(5)換蠟：將(4)中二甲苯倒掉，恒溫箱調(diào)至60 ℃使二甲苯蒸發(fā)1 h，加入融化的新蠟，4.5 h內(nèi)換純蠟2次(每隔1.5 h換純蠟1次)。

(6)包埋：準(zhǔn)備好紙盒、鑷子以及融化的蠟，將紙盒擺放好，倒入二分之一融化的蠟，用酒精燈燒過(guò)的鑷子夾出莖尖，調(diào)整好位置，等待冷卻成塊即可。

(7)修片與切片：將包埋好的蠟塊修成凸?fàn)睿M量使各平面保持平整，將帶有莖尖的部分凸出，用小刀在酒精燈上燒熱，輕觸蠟片底部，然后迅速移至小木塊上粘住。調(diào)整刀片與石蠟的角度約為15°，切片厚度10～15 μm。

(8)展片：準(zhǔn)備一個(gè)干凈的方形水缸，倒入加熱至45 ℃左右的純水，將切好的蠟帶輕輕放入水中展開，用載玻片撈出，吸水紙吸干水分，放置在40 ℃烘片機(jī)上烘干，后置于37 ℃恒溫箱內(nèi)過(guò)夜。

(9)脫蠟染色：二甲苯10 min，二甲苯10 min，50%二甲苯/50%乙醇溶液15 min，100%乙醇5 min，100%乙醇5 min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，70%乙醇5 min，50%乙醇5 min，30%乙醇5 min，去離子水5 min。1%甲苯胺藍(lán)溶液10 min，蒸餾水10 min，100%酒精2 min，1∶1二甲苯∶乙醇1 min，二甲苯1 min。

(10)封片：在切片上滴1滴中性樹膠，用蓋玻片蓋住。

(11)熒光正置顯微鏡觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理下葉用萵苣表觀特征觀察

35 ℃高溫處理下7 d開始抽薹，25 ℃處理下均未出現(xiàn)抽薹現(xiàn)象，見圖1。25 ℃處理下植株總體長(zhǎng)勢(shì)較好，葉片肥大呈淺綠色，葉片數(shù)較多。35 ℃高溫處理下3 d、5 d時(shí)長(zhǎng)勢(shì)良好，葉片翠綠，與25 ℃處理相比基本沒有區(qū)別；第7天時(shí)植株莖伸長(zhǎng)開始發(fā)生抽薹現(xiàn)象，與25 ℃處理相比，植株長(zhǎng)勢(shì)稍弱，葉片開始變小，顏色變紫；第9天時(shí)植株莖伸長(zhǎng)，整體長(zhǎng)勢(shì)弱，葉片稀疏、弱小，頂端葉片開始呈現(xiàn)黃綠色，而此時(shí)25 ℃對(duì)照組長(zhǎng)勢(shì)較好，葉片寬大呈翠綠色。35 ℃高溫脅迫下葉用萵苣容易發(fā)生提前抽薹現(xiàn)象，長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酢?/p>

注：A-D分別為25 ℃處理3、5、7、9 d植株，E-H分別為35 ℃處理3、5、7、9 d植株

2.2 不同溫度處理下葉用萵苣莖長(zhǎng)變化

為了能夠直觀準(zhǔn)確觀察不同處理下葉用萵苣‘s39’抽薹前后莖長(zhǎng)變化，明確高溫對(duì)葉用萵苣莖長(zhǎng)的影響。分別取35 ℃、25 ℃處理下3、5、7、9 d莖部，每個(gè)時(shí)期處理選取3株重復(fù)，測(cè)量莖長(zhǎng)，結(jié)果見圖2。25 ℃處理下，3、5、7、9 d植株莖的長(zhǎng)度增高幅度不大，基本保持在同一水平，均在2～3 cm之間，無(wú)顯著變化。35 ℃處理時(shí)3 d和 5 d葉用萵苣植株莖的長(zhǎng)度變化不大，總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，第7天莖長(zhǎng)明顯增加，為25 ℃常溫對(duì)照組的1.57倍，差異顯著。第9天莖持續(xù)伸長(zhǎng)，達(dá)到了25 ℃常溫對(duì)照組的2.33倍。35 ℃高溫處理對(duì)葉用萵苣抽薹影響顯著，能夠促進(jìn)葉用萵苣提早抽薹。

圖2 不同溫度處理下葉用萵苣莖長(zhǎng)變化(P<0.05)

2.3 不同溫度處理下葉用萵苣莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)變化

為進(jìn)一步探究高溫對(duì)葉用萵苣抽薹的影響，運(yùn)用石蠟切片技術(shù)觀察植株莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)在不同溫度處理下抽薹前后的變化。25 ℃處理下3、5、7、9 d莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)均呈現(xiàn)扁平狀態(tài)，未出現(xiàn)生長(zhǎng)錐凸起現(xiàn)象，說(shuō)明植株一直處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，未發(fā)生抽薹現(xiàn)象。35 ℃處理下，第3天呈現(xiàn)扁平狀，無(wú)頂端生長(zhǎng)點(diǎn)凸起現(xiàn)象；第5天生長(zhǎng)點(diǎn)開始略有凸起，微微呈拱形，植株開始進(jìn)行發(fā)芽分化；第7天抽薹時(shí)，出現(xiàn)圓錐形生長(zhǎng)點(diǎn)，頂端分生組織凸起明顯。第9天時(shí)生長(zhǎng)點(diǎn)繼續(xù)生長(zhǎng)，表明植株莖進(jìn)一步伸長(zhǎng)，見圖3。

注：A-D分別為25 ℃處理3、5、7、9 d植株，E-H分別為35 ℃處理3、5、7、9 d植株

3 討 論

抽薹對(duì)植物產(chǎn)量和品質(zhì)影響巨大，尤其對(duì)于以葉為食用部位的植物，抽薹開花使其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，口感苦澀，因此抑制抽薹開花是保障高產(chǎn)和品質(zhì)的關(guān)鍵[17]，葉用萵苣是溫敏型蔬菜，高溫引起抽薹造成食用經(jīng)濟(jì)價(jià)值喪失的現(xiàn)象屢見不鮮?！畇39’是葉用萵苣熱敏易抽薹品種，常溫下生長(zhǎng)45 d抽薹[18]，明確葉用萵苣‘s39’在高溫脅迫下抽薹時(shí)間以及抽薹前后形態(tài)變化，對(duì)研究葉用萵苣抽薹的生理和分子機(jī)制具有關(guān)鍵意義。本研究選取中國(guó)夏季普遍可達(dá)到的溫度35 ℃作為高溫組，以葉用萵苣正常生長(zhǎng)溫度25 ℃為對(duì)照組，35 ℃高溫組，第7天發(fā)生明顯抽薹現(xiàn)象，對(duì)照組生長(zhǎng)狀況良好，未發(fā)生抽薹現(xiàn)象。同時(shí)，取葉用萵苣莖尖運(yùn)用石蠟切片技術(shù)觀察莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)抽薹前后變化，第7天抽薹時(shí)，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)出現(xiàn)圓錐形凸起，并且逐漸變大。張利利等[6]在葉用萵苣‘GB-30’和‘GB-31’抽薹特性研究中發(fā)現(xiàn)42 ℃高溫處理下第8天發(fā)生抽薹，與本研究結(jié)果相似。高溫處理7 d為葉用萵苣‘s39’抽薹時(shí)間，可為葉用萵苣高溫抽薹研究提供依據(jù)。

采用石蠟切片技術(shù)操作簡(jiǎn)單，可以清晰觀測(cè)到高溫脅迫下葉用萵苣莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的變化狀況，試驗(yàn)過(guò)程中主要改良石蠟切片技術(shù)中的脫水和染色步驟，常規(guī)脫水從70%乙醇開始，每次間隔1～2 h，針對(duì)葉用萵苣莖尖細(xì)嫩、含水量大等特點(diǎn)，脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，因此本試驗(yàn)脫水選擇從50%乙醇開始，每次間隔0.5 h，增加梯度，縮減間隔時(shí)間，保證莖尖組織結(jié)構(gòu)的完整性。本試驗(yàn)摒棄傳統(tǒng)的番紅固綠染色方法，采用甲苯胺藍(lán)染色石蠟切片技術(shù)觀察莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，能更有效使染色液和莖尖組織結(jié)合，但在試驗(yàn)中出現(xiàn)染色不均勻現(xiàn)象，推測(cè)是由于試驗(yàn)過(guò)程中換新染料溶液或是溶液比例不當(dāng)?shù)脑?。采用傳統(tǒng)切片方式進(jìn)行切片，出現(xiàn)樣品切碎或變形等問題，對(duì)葉用萵苣莖尖傷害較大。后續(xù)應(yīng)該進(jìn)一步探究適合葉用萵苣莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的石蠟切片方法，使之更加簡(jiǎn)便易操作。