駱 言，劉 洪，黎 穎＊＊，宋 娜，熊維建，張 玲，丁偉森

（1. 重慶市中醫(yī)院腎病科 重慶 400021；2. 重慶市中醫(yī)院腫瘤科 重慶 400021）

目前慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）全球發(fā)病率約為10%-15%，如何防治CKD 已成為全球醫(yī)療系統(tǒng)需面臨的巨大挑戰(zhàn)[1-2]。腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是各種CKD 進(jìn)展到終末期腎病的共同途徑和病理特征，如何減輕RIF 對(duì)于延緩CKD 進(jìn)程具有重要意義[3]。根據(jù)我科多年臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合國醫(yī)大師鄭新中醫(yī)理論及有效醫(yī)案3000 余份總結(jié)[5]，腎衰靈方在臨床治療慢性腎臟病效果顯著。腎衰靈方治療慢性腎衰的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究論證。

近年研究發(fā)現(xiàn)音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）信號(hào)通路在RIF 中發(fā)揮重要作用[6-10]。本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral ureterul obstruction，UUO）大鼠模型模擬RIF，觀察在腎衰靈方作用下，RIF 的病理變化以及SHH 信號(hào)通路中SHH、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1（Glioma related cancer gene homologous proteins 1，Gli1）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail Family Zinc Finger 1，Snai1）蛋白表達(dá)水平，探討腎衰靈方通過抑制SHH信號(hào)通路改善RIF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

SPF 級(jí) 雄 性 SD 大 鼠 共 80 只 ，7 周 齡 ，體 質(zhì) 量（200±20）g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK：2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

腎衰靈方由中藥飲片大黃、黨參、黃芪、生龍牡、紅花、菌靈芝、當(dāng)歸、丹參，淫羊藿，蒲公英等組成，經(jīng)高壓滅菌密封制成（濃縮為含生藥1.2 g·mL-1）。本課題組用于研究的腎衰靈方由上訴飲片組成，由重慶市中藥研究所加工而成。

1.3 試劑及儀器

兔抗鼠SHH 多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗鼠Gli1 多克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司），鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國Affinity Biosciences 公司），兔抗鼠Snail單克隆抗體（英國Abcam 公司），大鼠結(jié)締生長因子（CTGF）PCR 試劑盒，ECL 發(fā)光試劑盒（碧云天生物科技有限公司），PVDF膜（美國Millipore公司），引物及GAPDH（上海生工生物有限公司）。AU400 全自動(dòng)生化分析儀（日本OLYMPUS 公司）；BX51T-PHD-J11 型顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；80-2 型低速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；圖像采集系統(tǒng)CMOS（日本OLYMPUS 公司），Image-Pro Plus（美國Media Cybernetics公司）等。

1.4 大鼠分組和造模

1.4.1 分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將50 只SD 大鼠隨機(jī)分為5 組：假手術(shù)組、模型組、腎衰靈方低劑量組、腎衰靈方中劑量組、腎衰靈方高劑量組，每組10只。假手術(shù)組模型制備：大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，采用左側(cè)背部切開腹腔，鈍性分離左側(cè)輸尿管，再分層縫合關(guān)閉腹腔。UUO 模型制備：大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，采用左側(cè)腹部切開腹腔，鈍性分離左側(cè)輸尿管，于中上1/3 處以4-0 線雙重結(jié)扎后切斷輸尿管，分層縫合關(guān)閉腹腔。腎衰靈組將UUO模型大鼠按照《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)》換算大鼠用藥量，低中高劑量組分別予以 5 mg·kg-1，15 mg·kg-1，25 mg·kg-1劑量進(jìn)行灌胃，分別相當(dāng)于成人臨床劑量5 倍、10 倍、15 倍，持續(xù)治療14天。假手術(shù)組及模型組予以蒸餾水按15 mg·kg-1劑量進(jìn)行灌胃。

根據(jù)結(jié)果選取腎衰靈療效最佳劑量組，再次采用隨機(jī)數(shù)字表法將30 只SD 大鼠隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組、模型組、腎衰靈方組，每組10只。

1.4.2 血液生化指標(biāo)檢測

造模治療14天后，禁食禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟取血，常溫靜置1 h，3 500 r·min-1離心5 min，取上清液以備用，根據(jù)全自動(dòng)生化分析儀測定血清血清尿素氮（BUN），肌酐（SCr），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），堿性磷酸酶（ALP），乳酸脫氫酶（LDH）含量。

1.4.3 Masson染色觀察膠原纖維沉積

石蠟切片后按試劑說明行馬松（Masson）染色，脫水、透明，中性樹膠封片，觀察腎組織病理學(xué)改變。400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不重疊視野，細(xì)纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定其陽性（藍(lán)色）區(qū)域面積與該視野下總面積（除去腎小管管腔），以二者百分比計(jì)算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率。

1.4.4 Real-time PCR 檢測CTGF的表達(dá)

將Trizol法提取的組織RNA用紫外分光光度計(jì)測定濃度后，取2 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用DNA Engine OpticonTM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀以 20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以β-Actin 為內(nèi)參照。采用RESTXL 軟件作基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。引物如下：CTGF-F：5’-CGT ACC ATA TGT TCT GAC AG-3’，CTGF-R：5’-GAA AGA CAG GTA CTA GCT GA-3’；β-Actin-F：5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，β-Actin-R：5’-GCTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’。

1.4.5 免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snail蛋白表達(dá)情況

根據(jù)血清學(xué)指標(biāo)及Masson 染色結(jié)果，我們選擇治療效果最佳的腎衰靈組繼續(xù)行WB實(shí)驗(yàn)。提取腎組織蛋白，蛋白定量后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，分別加入I 抗（1∶1 000），搖床4℃孵育過夜，加 II 抗（1∶2 000），37℃孵育 120 min，ECL 顯色，暗室曝光成像，采用Image J 圖像分析灰度值，計(jì)算目的蛋白和GAPDH 條帶吸光值的比值反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)指標(biāo)含量

腎功能：與假手術(shù)組比較，模型組和腎衰靈各劑量組SCr 和BUN 水平均明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，腎衰靈各劑量組SCr和BUN水平均明顯降低，其中腎衰靈中劑量組SCr和BUN水平最低（P<0.05）。

肝功能：各組間ALT、AST、ALP、LDH 水平無顯著差異（P>0.05），提示腎衰靈各劑量組安全性良好。（見表1）。

2.2 腎組織解剖觀察

假手術(shù)組腎臟大小正常，暗紅色質(zhì)軟；模型組左側(cè)腎臟明顯腫脹增大，暗褐色，包膜緊張，切開內(nèi)可見渾濁積液，腎盂腎盞擴(kuò)張變形，腎皮質(zhì)較正常組明顯變?。荒I衰靈高、中、低劑量組腎臟腫脹，暗褐色，腎皮質(zhì)較模型組稍厚。

2.3 Masson染色觀察腎組織纖維化

Masson 染色后結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠腎小球基底膜、系膜、及小管周圍間質(zhì)僅有少量間質(zhì)膠原沉積，模型組腎小球數(shù)量明顯減少、腎小球嚴(yán)重萎縮，炎性細(xì)胞彌漫浸潤，大量間質(zhì)膠原纖維環(huán)狀沉積于腎小球上皮組織、基底膜區(qū)等，提示模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化明顯，腎衰靈方治療組，腎間質(zhì)膠原沉積較模型組明顯減輕，提示腎間質(zhì)纖維化明顯改善。在200 倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)不相重疊的腎小管間質(zhì)視野，分別測量每個(gè)視野中腎小管間質(zhì)纖維化的相對(duì)面積，取平均值進(jìn)行半定量分析，計(jì)算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比（0.54±0.04），模型組（8.57±1.49），腎衰靈低劑量組（3.95±0.92），腎衰靈中劑量組（2.67±0.54），腎衰靈高劑量組（3.05±1.04），與假手術(shù)組相比，其余各組膠原纖維沉積率明顯增高（P<0.01）。與模型組相比，腎衰靈高中低組膠原纖維沉積率明顯降低（P<0.01），其中腎衰靈中劑量組效果最佳（圖1）。

2.4 real-time PCR檢測CTGF表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，模型組CTGF mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），與模型組比較，腎衰靈方高、中、低劑量組中CTGF mRNA 表達(dá)顯著下降（P<0.01），與高劑量組及低劑量組比較，中劑量組CTGFmRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），見表2。

2.5 Western blot 檢測各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snail蛋白表達(dá)情況

根據(jù)血清學(xué)指標(biāo)及Masson 染色結(jié)果，我們選擇腎衰靈中劑量組進(jìn)一步檢測SHH 及其下游信號(hào)分子蛋白表達(dá)水平。Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎組織內(nèi)SHH，Gli1，Snail 蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組顯著增強(qiáng)（P<0.05），與模型組比較，腎衰靈組腎組織中SHH，Gli1，Snail 蛋白的表達(dá)明顯下降（P<0.05）（圖2，表3）。

3 討論

腎衰靈方是國醫(yī)大師鄭新在臨證60 余載經(jīng)驗(yàn)效方，鄭老精通中醫(yī)四大經(jīng)典，融古通今，善于運(yùn)用健脾補(bǔ)腎、活血化瘀、搜風(fēng)通絡(luò)等方法治療腎臟相關(guān)疾病。鄭老認(rèn)為脾腎虧虛為起病之本，故治療腎臟疾病多采用補(bǔ)益脾腎為基礎(chǔ)。慢性腎臟病病程較長，患者脾胃虧虛，故口服藥物吸收欠佳，鄭老根據(jù)臟腑理論為基礎(chǔ)，總結(jié)出臟病治腑，瀉腑以補(bǔ)臟，即六腑以通為補(bǔ)。腎衰靈方以大黃為君藥，通腑瀉濁，活血化瘀，龍骨、牡蠣收斂固澀，與大黃配伍散中有收，防止大黃瀉下傷正，另外慢性腎臟病久病體虛，一味攻伐忽視其本虛，或可取一時(shí)之效，療效難以持續(xù)，日久反使正氣更虛，故方中加黨參、黃芪、菌靈芝補(bǔ)氣扶正以化生氣血，淫羊藿補(bǔ)益腎陽，紅花、當(dāng)歸、丹參活血養(yǎng)血，蒲公英苦以開泄，利濕散結(jié)，為引經(jīng)之藥。本方充分反映了鄭老重視脾腎、益氣養(yǎng)血、活血化瘀的治療法則。腎衰靈方保留灌腸在臨床治療慢性腎臟病效果極佳，可明顯延緩慢性腎臟病患者進(jìn)入血液透析治療，提高患者生活質(zhì)量。臨床上，SCr 及BUN 通常被稱作腎功能排毒不佳的標(biāo)志，可根據(jù)SCr 及BUN 對(duì)慢性腎臟病患者進(jìn)行臨床分期，是評(píng)估慢性腎臟病發(fā)病及發(fā)展最簡單有效的經(jīng)典指標(biāo)。課題組臨床中根據(jù)患者血清檢驗(yàn)可測得運(yùn)用腎衰靈方灌腸治療一個(gè)療程的患者血清中SCr及BUN可得到明顯下降。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠血清中SCr及BUN正常，說明假手術(shù)組大鼠腎功能正常未受假手術(shù)影響。UUO 大鼠模型組血清中SCr 及BUN 明顯升高，提示腎間質(zhì)纖維化大鼠腎功能受到明顯損害，模型大鼠造模成功，而腎衰靈方組大鼠血清中的SCr 及BUN 明顯降低，能降低模型大鼠血清中SCr 及BUN，提示腎衰靈方對(duì)模型大鼠腎臟功能有保護(hù)作用，能有效地降低模型大鼠血清中的腎衰指數(shù)。

表1 各組大鼠SCr、BUN含量比較（，n=10）

表1 各組大鼠SCr、BUN含量比較（，n=10）

注：*P<0.05與假手術(shù)組比較，#P<0.05與模型組比較，△P>0.05與假手術(shù)組比較。

LDH/U·L-1 181.33±12.79 174.67±13.94△173.67±845△170±8.81△170.83±12.79△組別假手術(shù)組模型組腎衰靈低劑量組腎衰靈中劑量組腎衰靈高劑量組Crea/μmol·L-1 34.11±2.23 52.82±9.13*42.63±8.12#40.30±8.01#43.30±8.61*#BUN/mmol·L-1 4.41±0.69 7.35±1.62*5.68±0.96*#5.27±0.44*#6.10±1.44*#ALT/U·L-1 261.17±40.33 265.5±30.93△260±41.53△255.17±38.03△279.17±32.34△AST/U·L-1 79.17±8.38 74.17±11.72△69.83±8.89△77±10.26△75.5±9.57△ALP/U·L-1 132.5±17.22 140.5±11.61△136±16.57△134.5±17.04△135.67±21.29△

圖1 各組大鼠腎臟組織Masson染色（×200）

表2 腎衰靈方對(duì)各組大鼠腎組織CTGFmRNA表達(dá)的影響（，n=10）

表2 腎衰靈方對(duì)各組大鼠腎組織CTGFmRNA表達(dá)的影響（，n=10）

注：*P <0.01 與假手術(shù)組比較，#P <0.01 與模型組比較，與腎衰靈方中劑量比較△P<0.05。

CTGF 0.375±0.033 1.093±0.051*0.758±0.052#△0.652±0.028#0.974±0.063#△組別假手術(shù)組模型組腎衰靈組高劑量組腎衰靈組中劑量組腎衰靈組低劑量組

圖2 Western Blot測得各組大鼠腎組織中SHH，Gli1，Snai1蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snai1蛋白表達(dá)情況（，n=10）

表3 各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snai1蛋白表達(dá)情況（，n=10）

注：*P<0.05與假手術(shù)組比較，#P<0.05與模型組比較。

Snai1 0.323±0.132 1.235±0.217*0.841±0.961*#組別假手術(shù)組模型組腎衰靈組SHH 0.554±0.191 1.634±0.372*1.039±0.188*#Gli1 0.214±0.117 1.269±0.121*0.717±0.078*#

臨床上慢性腎臟病腎組織解剖相對(duì)較少，彩超等檢查可見腎組織皮質(zhì)變薄。模型大鼠腎組織解剖觀察可見：假手術(shù)組腎臟大小正常，暗紅色質(zhì)軟；而模型組左側(cè)腎臟明顯腫脹，暗褐色，包膜緊張，切開內(nèi)可見渾濁積液，腎盂腎盞擴(kuò)張變形，腎皮質(zhì)較正常組明顯變薄，提示腎間質(zhì)纖維化模型大鼠造模成功；而腎衰靈組腎臟腫脹，暗褐色，腎皮質(zhì)較模型組稍厚提示在運(yùn)用腎衰靈方作用的模型大鼠腎組織損傷有所緩解，提示腎臟疾病進(jìn)程較模型大鼠有所減緩。腎臟Masson 染色中顯示腎小球數(shù)量明顯減少、腎小球嚴(yán)重萎縮，炎性細(xì)胞彌漫浸潤，大量間質(zhì)膠原纖維環(huán)狀沉積于腎小球上皮組織、基底膜區(qū)等，提示模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化明顯，腎衰靈方治療各組腎間質(zhì)膠原沉積較模型組明顯減輕，提示腎間質(zhì)纖維化明顯改善。從微觀角度證明造模成功，另外腎衰靈方可以改善模型大鼠腎功能，改善模型大鼠腎間質(zhì)纖維化情況，根據(jù)血清學(xué)及病理學(xué)評(píng)估腎衰靈方中劑量組效果最佳。通過肝功相關(guān)指標(biāo)檢測，提示腎衰靈方安全性良好，不會(huì)引起肝功能異常。

腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎病的共同途徑和病理特征，在此過程中有效腎單位逐漸喪失、腎功能進(jìn)行性下降。研究證實(shí)RIF嚴(yán)重程度與腎功能下降程度密切相關(guān)，是一項(xiàng)決定預(yù)后的有效指標(biāo)。研究提示，結(jié)締生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）是一種可刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌膠原蛋白的生長因子，在RIF進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[12-14]。CTGF的檢測，可以看出腎衰靈方各劑量組相較模型組大鼠均有治療作用，其中中劑量組大鼠CTGF 的表達(dá)最低，提示纖維細(xì)胞增殖相對(duì)受到抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)在各種原因所致慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）患者中SHH 在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)；這一結(jié)果在各種大鼠腎纖維化模型中也被證實(shí)，這提示SHH 信號(hào)通路激活是各種腎臟疾病的共同病理結(jié)果[15]。經(jīng)典SHH 信號(hào)通路活化途徑為SHH 經(jīng)過自動(dòng)的催化裂解后與細(xì)胞膜受體跨膜蛋白Patched（Ptch）結(jié)合，解除對(duì)Smoothened（SMO）的抑制，SMO 解除了 Gli1 磷酸化等過程，從而使Gli1 以全長形式入核啟動(dòng)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]，其中Gli1 是SHH 信號(hào)通路的重要的多功能轉(zhuǎn)錄因子，其激活使反應(yīng)SHH 信號(hào)通路活性的可靠指標(biāo)。SHH-Gli1 通路通過促進(jìn)細(xì)胞增殖參與RIF 發(fā)生發(fā)展[17-18]。通過大鼠基因敲除Gli1-LacZ 揭示SHH-Gli1通路是腎纖維化必不可少的信號(hào)通路[19]。研究表明Snai1 具有介導(dǎo)細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）的作用，廣泛參與發(fā)育、腫瘤、纖維化過程[20]。EMT 是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，研究表明EMT 在RIF 的發(fā)病機(jī)制中同樣起到關(guān)鍵作用[21-24]。最近研究發(fā)現(xiàn)SHH/Gli1 通路可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snai1 的表達(dá)[25]，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)活化SHH/Gli1 可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snai1表達(dá)，精密調(diào)控EMT 的發(fā)生[26-27]。由此可假設(shè)SHH-Gli1-Snai1 信號(hào)通路是腎組織在EMT 過程中導(dǎo)致RIF 的信號(hào)通路。綜上，若阻斷SHH 信號(hào)通路，則SHH 的表達(dá)下降，則下游信號(hào)通路分子Gli1 及Snai1也會(huì)隨之下降。據(jù)此，我們假設(shè)腎衰靈方阻止腎臟細(xì)胞纖維化是通過阻斷SHH 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，故設(shè)計(jì)本次三組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。模型組SHH、Gli1、Snai1 蛋白表達(dá)顯著升高，提示腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)明顯升高，提示模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化明顯。且可能是大鼠腎間質(zhì)纖維化的信號(hào)通路。而腎衰靈方組中SHH、Gli1、Snai1蛋白表達(dá)顯著降低，提示腎衰靈方能降低腎間質(zhì)纖維化SHH、Gli1、Snai1 蛋白指標(biāo)的表達(dá)，提示腎衰靈方可能通過抑制SHH、Gli1、Snai1 的表達(dá)從而抑制腎間質(zhì)纖維化。而SHH、Gli1、Snai1 蛋白的表達(dá)上升與下降方向明顯相同，提示SHH-Gli1-Snai1信號(hào)通路存在，腎衰靈方對(duì)模型大鼠纖維化指標(biāo)改善明顯，提示腎衰靈方可能作用于SHH-Gli1-Snai1 三種蛋白構(gòu)成的信號(hào)通路有明顯的抑制作用。綜上所述，腎衰靈方可能通過抑制SHH-Gli1-Snai1 信號(hào)通路阻斷EMT 抑制腎臟RIF。根據(jù)此，我們將開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將腎衰靈含藥血清作用于腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞，進(jìn)一步深入研究腎衰靈方對(duì)腎臟細(xì)胞纖維化的作用機(jī)制。