三種微生物鑒定技術的分析與應用

魏翠翠

青島中海海洋生物資源開發(fā)有限公司 山東青島 266108

我國食品安全監(jiān)督抽檢中微生物檢驗項目主要有菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母、致病菌4類。菌落總數反映食品被細菌污染的程度；大腸菌群反映食品是否有被糞便污染；霉菌和酵母可使食品腐敗變質，并產生真菌毒素危害人體健康；致病菌可能引起食物中毒[1]。

1 菌落總數的鑒定

菌落總數可反映被檢樣品在生產、加工及銷售過程中是否符合衛(wèi)生要求，可為被檢樣品的衛(wèi)生學評價提供依，是重要微生物指標。本文依據GB4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》和JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》對菌落總數進行了不確定度評定。在實際檢測過程中，檢測結果部分合格，有些在限量標準附近，這時僅依靠檢驗結果就直接進行判定是不合理的。測量不確定度是對測量結果質量的定量表征，很大程度上決定了測量結果的可用性。在ISO/IEC17025《校準和檢測實驗室能力的通用要求》中明確指出，檢測實驗室在必要時需對測量不確定度予以說明，如測定結果在限量值附近時，就要對測量結果進行不確定度的評定。

在食品微生物菌落總數測定能力驗證實施過程中，還應注意以下細節(jié)：

（1）樣品處理，應嚴格按照指導書進行，特別是對西林瓶內容物進行水化時，采取盡可能將原液吸出后，多次潤洗瓶內壁，防止滴、漏、濺、灑，保證樣品處理的準確。

（2）磷酸鹽緩沖稀釋液液分裝、樣液接種時，應注意正確使用移液槍吸液，否則會導致多次稀釋后偏差增加。

（3）對于盲樣，在適宜的稀釋度不清楚的情況下，建議至少做6個稀釋梯度。

（4）推薦使用漩渦混勻器，應注意觀察混液是否混合均勻，若樣液不夠均勻，將導致結果出現偏差。

（5）培養(yǎng)基傾注溫度可維持在46-50℃，不可過高，否則可能使數值偏低。培養(yǎng)基厚度要適中，太厚影響菌落形成，太薄在培養(yǎng)48h后培養(yǎng)基可能會發(fā)生干燥現象，無法計數[2]。

2 大腸桿菌的鑒定

在菌落總數檢驗接種時，應該揭開培養(yǎng)皿的部分使檢液從側邊進入。檢液加入后，必須盡快傾注培養(yǎng)基混勻。傾注培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基應保持46℃，因為溫度過高培養(yǎng)皿中的細菌可能被燙死而影響結果的準確性，溫度過低培養(yǎng)基將凝固。當培養(yǎng)皿中瓊脂凝固后，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中36℃±1℃倒置培養(yǎng)48h±2h（水產品為30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h），培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)的原因主要有3個：1.防止培養(yǎng)皿正置培養(yǎng)時水分蒸發(fā)在培養(yǎng)蓋上形成冷凝水滴落而污染培養(yǎng)基；2.倒置培養(yǎng)后瓊脂表面不會有水膜，從而促使菌落的形成；3.倒置培養(yǎng)后菌落生長速度適宜，形成的菌落容易計數。

在大腸菌群檢驗過程中，平板法接種注意事項和菌落總數測定相似，也包括培養(yǎng)基傾注的溫度保持46℃，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。但是在使用MPN法測定前要注意杜氏扣管里是否有空氣，以免影響后續(xù)的觀察，增加工作量。在接種時應注意，當樣品接種體積＞1mL（一般為10mL）時應使用雙料培養(yǎng)基，而接種量≤1mL應用單料培養(yǎng)基，這是因為接種體積的增大會稀釋培養(yǎng)基使各成分濃度降低，因而使用雙料培養(yǎng)基。

在大腸菌群MPN法糖發(fā)酵實驗中，觀察是否產氣應對光傾斜觀察，有時杜氏扣管中會出現比米粒還小的氣泡干擾檢驗人員，這時可通過觀察發(fā)酵液是否渾濁，繼續(xù)培養(yǎng)是否產氣來判斷。對于GB4789.3-2016，亦可通過觀察發(fā)酵液是否變黃進行判斷，以確定是否進行下一步實驗。為保證實驗結果準確性，應同時做陰性對照、陽性對照試驗。當發(fā)現樣品初發(fā)酵陽性時，必須進行證實試驗，因為有許多研究表明，初發(fā)酵實驗陽性的試管，證實試驗結果可能為陰性。

在大腸菌群平板法驗證試驗中，可疑菌落的挑取驗證往往是檢驗人員認為比較棘手的問題。國標規(guī)定，挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個全部挑取，這句話常常讓檢驗人員不知如何理解。其實這里的典型菌落主要包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，建議檢驗人員初次實驗時取這四種細菌進行陽性對照試驗，然后注意觀察，并記錄典型大腸菌群形態(tài)，這樣就能區(qū)分出典型菌落和可疑菌落。正式試驗時，挑取典型菌落和可疑菌落各10個（或全部挑?。┻M行驗證，挑取菌落時可連同部分培養(yǎng)基挑出，以防漏挑。

3 霉菌的鑒定

在食品類樣品霉菌檢出率和檢出值都較低，對于霉菌和酵母菌計數的不確定評定帶來了一定難度，所以本研究以能力比對樣品為測試樣品，可以解決這個問題。霉菌在培養(yǎng)過程中存在因反復觀察而上下翻轉平板而導致霉菌孢子擴散，形成次生小菌落，影響計數結果。在CNAS-CL01-A001《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物領域的應用說明》中對實驗室提出要有防止孢子擴散的措施，這是影響檢測結果的一個重要因素，所以，在新的標準GB4789.15-2016中，將培養(yǎng)方式改為正置培養(yǎng)。另外，在均質時，不能用旋轉刀片式均質器，可能會切斷霉菌菌絲[22]，導致檢測結果偏高；同時，耐藥細菌的存在同樣會使檢測結果偏高。所以，在霉菌和酵母檢測過程中，孢子擴散、均質方式和耐藥細菌的存在同樣是影響檢測結果測量不確定度的重要因素[3]。

4 結語

食品質量安全與人們的健康生活息息相關，習近平總書記曾對食品質量安全工作作出重要指示，提出要堅持“最嚴謹的標準、最嚴格的監(jiān)管、最嚴厲的處罰、最嚴肅的問責”。作為一名基層食品微生物檢驗人員，在食品檢測技術日益發(fā)展的今天，更應該與時俱進，深刻掌握檢驗的相關原理以及注意要點。在菌落總數和大腸菌群時，要做到每一步驟操作精細準確，這樣才能保證檢驗結果準確可靠，為我國食品安全監(jiān)管貢獻出力量。