陸瑤，方盛國

（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生命系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護教育部重點實驗室/國家瀕危野生動植物種質(zhì)基因保護中心，杭州310058）

揚子鱷（Alligator sinensis）是我國特有的一種鱷類動物，也是世界上現(xiàn)存25種鱷類中最瀕危的物種之一[1-2]。受到過度捕獵和棲息地減少的雙重打擊，揚子鱷仍處于極度瀕危的狀態(tài)，野外種群數(shù)量不斷下降[1,3]。我國于20 世紀(jì)80 年代在安徽省宣城市和浙江省長興縣等地陸續(xù)建立了揚子鱷保護區(qū)，經(jīng)過近40年的人工繁育，揚子鱷圈養(yǎng)種群不斷壯大，為揚子鱷野生種群的重建和復(fù)壯提供了豐富的資源[4-5]。

然而，對有關(guān)圈養(yǎng)動物的研究表明，在人工飼養(yǎng)條件下動物面臨著一系列來自于環(huán)境的挑戰(zhàn)。人工光照、不適宜的環(huán)境溫度、非自然社群中的社會互動等都可能成為壓力源，影響個體對環(huán)境的適應(yīng)能力[6]。其中，飼養(yǎng)密度是影響鱷類飼養(yǎng)的一個重要因素，飼養(yǎng)密度過高會對動物的生長、繁殖和存活造成不利影響。在相對較高的飼養(yǎng)密度下，揚子鱷、寬吻凱門鱷、灣鱷等鱷類幼鱷的生長速率減慢[7-9]；并且，密河鱷的幼鱷和成鱷血漿中皮質(zhì)酮的水平顯著升高，原因是高飼養(yǎng)密度環(huán)境會刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸，引起動物強烈的應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。在家雞、魚類等動物的相關(guān)研究中還發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)密度過高會影響機體的免疫系統(tǒng)功能和免疫狀態(tài)，比如導(dǎo)致淋巴器官發(fā)育緩慢，由于免疫反應(yīng)減弱使得對病原體的抵抗能力下降，免疫器官中先天免疫基因的表達(dá)水平發(fā)生變化等[12-15]。

在脊椎動物中，應(yīng)激和免疫是十分重要的生理過程，使得機體能快速對環(huán)境中的有害因素如潛在的致病菌等產(chǎn)生反應(yīng)。揚子鱷為營半水生生活的爬行動物，生活在充滿潛在致病菌的水生環(huán)境中，先天免疫系統(tǒng)是其抵抗微生物入侵的第一道防線。而動物的先天免疫系統(tǒng)包括各種能非特異性識別并作用于病原體的免疫細(xì)胞和抗菌分子，防御素就是其中一類重要的抗菌物質(zhì)[16]。防御素由18～45個氨基酸殘基組成，是一類富含陽離子和半胱氨酸的小分子多肽[17]。防御素具有抗菌、趨化、免疫調(diào)節(jié)等作用，保證機體在感染病原體前保持強大的防御能力，并在感染后能迅速引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，在動物的先天免疫中發(fā)揮著重要的作用[18]。防御素在參與宿主免疫的細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，且在脾、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫器官和細(xì)胞中具有較高的表達(dá)水平[18]。并且，防御素的表達(dá)受多種壓力因素的調(diào)控，細(xì)菌、脂多糖、白細(xì)胞介素等外源因素均可引起防御素表達(dá)水平的變化[19]。

揚子鱷圈養(yǎng)種群長期生活在人工環(huán)境中，更多受到來自環(huán)境的壓力，進一步了解其免疫狀態(tài)可為揚子鱷的保護提供更多信息。因此，本研究利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）技術(shù)檢測揚子鱷七齡鱷群體血液中β防御素基因的表達(dá)情況，并進一步探究飼養(yǎng)密度對揚子鱷圈養(yǎng)群體β防御素表達(dá)的影響，為揚子鱷種群的管理和保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象及試驗材料

本研究于2018 年7 月在浙江省長興縣揚子鱷省級自然保護區(qū)內(nèi)開展，研究對象為2011年出生的揚子鱷七齡鱷群體（n=98），分別飼養(yǎng)于A 和B 2 個飼養(yǎng)池中。通過測量A和B 2個方形飼養(yǎng)池的長寬計算其面積和鱷魚的飼養(yǎng)密度；用手指觸摸揚子鱷的泄殖腔，根據(jù)泄殖腔背壁上方有無棒狀交媾器判斷揚子鱷的性別[5]。一共采集了41個揚子鱷個體的血液樣品用于后續(xù)試驗，并利用保護區(qū)內(nèi)因打斗而死亡的1頭揚子鱷個體的凍存組織樣品（心、肝、腦、肺、腎、胃、小腸、肌肉）的RNA 進行引物設(shè)計和篩選。本研究的試驗對象和樣品信息如表1所示。

表1 揚子鱷七齡鱷群體特征和樣本信息Table 1 Information of seven-year-old Chinese alligator populations and samples

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)]、TB GreenTMPremix ExTaqTM熒光染料、pMD18-T載體克隆試劑盒、EcoRⅠ酶等購自日本TaKaRa 公司；PCR 擴增試劑2×Taq主混料、GRgreenⅡ核酸染料、薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于天根生化科技（北京）有限公司；QIAprep Spin質(zhì)粒小量提取試劑盒購于德國QIAGEN公司。

1.3 血液和組織的RNA 提取及cDNA 合成

血液和組織樣品總RNA 均按照TRIzol 法進行提取，但第1步細(xì)胞裂解的方法不同：前者為將新鮮血液直接加入到TRIzol 試劑中并劇烈振蕩約30 min，至血細(xì)胞完全裂解；后者為將組織樣品在液氮中快速研磨成粉末，隨后轉(zhuǎn)移至裝有TRIzol試劑的離心管中振蕩約10 min。提取總RNA 后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用超微量分光光度計測定RNA的質(zhì)量濃度和純度。

選擇質(zhì)量濃度在200 ng/μL 以上、D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0 之間的RNA 樣品為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，每20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系中加入總量為1 000 ng的RNA。

1.4 引物設(shè)計與篩選

根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中19個揚子鱷β防御素基因的cDNA 序列（GenBank登錄號：MG519833～MG519852，不包括假基因AsBD103p），利用軟件Primer Premier 5.0 分別設(shè)計多對熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）引物，由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.4.1 PCR 擴增

如果在PCR實驗中未能擴增出條帶，可能是因為該基因在組織中沒有表達(dá)或者是該引物不合適。所以，為了盡可能排除引物自身問題導(dǎo)致的PCR擴增失敗，并且盡可能多地篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的引物，本實驗將不同的血液cDNA 和組織cDNA 進行混合，用于之后的實驗。

PCR 反應(yīng)體系：2×Taq主混合液5μL，無RNase ddH2O 3 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min：94 ℃變性40 s，在最適退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。其中，設(shè)置退火溫度的溫度梯度，得到最亮的擴增條帶所對應(yīng)的溫度為最適退火溫度。

使用DNA 回收試劑盒回收PCR 陽性產(chǎn)物，并連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后使用含氨芐的選擇性固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；篩選出陽性克隆并進行搖菌，送菌液至北京擎科生物科技有限公司杭州分公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI 上與目的片段序列進行Blast 比對，確定PCR擴增的片段是否為目的片段。

1.4.2 qPCR 擴增

初步確定引物之后進行qPCR實驗，qPCR擴增體系：TB GreenTMPremix ExTaqⅡ5 μL，無RNase ddH2O 3 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL。qPCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，在最適退火溫度下退火30 s，39 個循環(huán)。擴增反應(yīng)完成后，每5 s 升溫0.5 ℃，從65 ℃升溫到95 ℃，得到熔解曲線。其中，設(shè)置退火溫度的溫度梯度，閾值（CT）最小值對應(yīng)的退火溫度為最適退火溫度；熔解曲線要求為單一尖銳峰。對于滿足上述條件的qPCR引物，再次擴大培養(yǎng)含有陽性克隆的菌液，使得細(xì)胞濃度約為3×109mL－1。根據(jù)QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，使用EcoRⅠ酶將環(huán)狀質(zhì)粒酶切為線性質(zhì)粒，得到質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)質(zhì)粒DNA濃度計算質(zhì)?？截悢?shù)，計算公式為：

質(zhì)粒拷貝數(shù)/(copies/μL)=6.02×1023/(copies/mol)×10－9×質(zhì)粒質(zhì)量濃度/(ng/μL)÷（DNA長度/bp×660）.

最后，使用Tris-乙二胺四乙酸（TE）緩沖液將質(zhì)粒DNA稀釋10倍，得到拷貝數(shù)為102～108共7個梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到引物的擴增效率E和相關(guān)系數(shù)r2，要求E為90%～110%，r2＞0.99。

1.5 揚子鱷血液中β防御素基因表達(dá)情況的檢測

利用篩選出的多個β防御素基因引物對揚子鱷七齡鱷群體中41個個體的血液RNA樣品進行qPCR檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）為內(nèi)參基因，其qPCR 引物參照TANG 等[20]設(shè)計的引物。每次實驗均設(shè)置陰性對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

通過qPCR實驗得到的CT值和熔解曲線判斷基因的表達(dá)情況，如該基因擴增過程中的熔解曲線與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時的熔解曲線不同，說明擴增的片段不是目的片段，從而認(rèn)定該基因在樣品中未表達(dá)。如該基因有表達(dá)，則重復(fù)實驗3次（要求標(biāo)準(zhǔn)偏差＜0.5），取CT均值進行后續(xù)的相對定量表達(dá)分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

首先，通過計算目的基因與內(nèi)參基因的差值ΔCT判斷各目的基因之間的相對表達(dá)情況：ΔCT越小，則說明基因的相對表達(dá)量較高。再以某個揚子鱷個體的基因表達(dá)量作為參照計算出2－△△CT值，得到揚子鱷不同個體間基因的相對表達(dá)倍數(shù)。然后，利用軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析：采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗和Pearson 相關(guān)系數(shù)分析各表達(dá)基因之間表達(dá)水平（ΔCT）的相關(guān)性；采用Levene檢驗、獨立樣本T檢驗和Mann-WhitneyU檢驗分析不同性別、不同飼養(yǎng)密度的2 個群體中各防御素基因的相對表達(dá)倍數(shù)（2－△△CT）之間的差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 揚子鱷血液（A）和組織（B）總RNA的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram results of total RNA in blood(A)and tissues(B)of Chinese alli gator

2 結(jié)果與分析

2.1 血液和組織總RNA 的提取結(jié)果

血液和組織的RNA經(jīng)電泳檢測，清晰可見28S和18S 2種條帶（圖1），說明RNA樣品質(zhì)量良好，可用于后續(xù)的實驗。

2.2 qPCR 引物篩選

在PCR實驗中，一共設(shè)計出10個β防御素基因的引物，均能擴增出清晰的條帶并且單個陽性克隆的測序結(jié)果與目的片段序列一致。但是，在進一步的qPCR實驗中發(fā)現(xiàn)，AsBD106α基因引物的熔解曲線不是單一尖銳峰，很可能是由于AsBD106α基因與AsBD106β基因cDNA 序列高度相似（93%），在PCR擴增過程中很難將兩者區(qū)分開。最終，成功設(shè)計篩選出9 個β防御素基因的qPCR 引物，所有的qPCR引物（包括內(nèi)參基因GAPDH）的信息見表2。

2.3 揚子鱷β 防御素基因的血液表達(dá)譜

經(jīng)qPCR檢測，在揚子鱷群體的血液中表達(dá)的β防御素基因只有AsBD5和AsBD8，其余基因均未表達(dá)。其中，AsBD8與內(nèi)參基因GAPDH的差值ΔCT小于AsBD5的ΔCT值，說明在揚子鱷血液中AsBD8的表達(dá)量高于AsBD5。并且，每個個體AsBD5和AsBD8的表達(dá)量之間存在較顯著的正相關(guān)性（r=0.576，P＜0.05）。而 在 不 同 個 體 間，AsBD5和AsBD8的表達(dá)水平均具有一定的差異；其中AsBD8表達(dá)水平的個體差異很大，不同個體間的相對表達(dá)量差異可達(dá)20倍以上（圖2）。

2.4 性別和飼養(yǎng)密度對揚子鱷防御素基因表達(dá)的影響

雌性和雄性揚子鱷血液中防御素基因AsBD5和AsBD8的表達(dá)水平無顯著性差異（圖3A），但是2個不同飼養(yǎng)密度的揚子鱷群體間AsBD5和AsBD8基因的表達(dá)水平均存在極顯著差異（P＜0.001；圖3B）。其中，生活在較高飼養(yǎng)密度飼養(yǎng)池B（0.55 頭/m2）中的揚子鱷群體防御素的表達(dá)水平顯著高于飼養(yǎng)池A（0.30 頭/m2），說明這2 個群體間的免疫狀態(tài)存在顯著差異，飼養(yǎng)密度較高的群體具有更高的免疫水平。

3 討論

本研究通過RT-qPCR 對揚子鱷血液中β防御素基因的表達(dá)情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)了在揚子鱷血液中表達(dá)的2 種防御素基因AsBD5和AsBD8，并且AsBD5和AsBD8的表達(dá)量在個體之間存在顯著的正相關(guān)性。已知AsBD5和AsBD8是揚子鱷基因組上相鄰的2個基因，表明這2個功能相關(guān)的基因之間可能存在共同進化的現(xiàn)象[21]。而在不同個體間，AsBD5和AsBD8表達(dá)水平的差異很可能與動物的免疫狀態(tài)、家系等有關(guān)[22]。結(jié)合本實驗之前關(guān)于揚子鱷β防御素基因組織表達(dá)的研究，可對揚子鱷防御素基因家族的表達(dá)情況有一個更加全面的了解。AsBD5和AsBD8是與鳥類β防御素基因同源的2個直系基因，在揚子鱷的血液、脾和結(jié)腸等免疫相關(guān)組織中均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，說明這2 個基因在揚子鱷的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[20]。

表2 qPCR引物信息Table 2 Primer information for qPCR

圖2 揚子鱷七齡鱷群體血液中β 防御素基因AsBD5 和AsBD8的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of β-defensin genes AsBD5 and AsBD8 in blood of seven-year-old Chinese alligators

目前，已有較多物種完成了防御素基因家族的解析，但有關(guān)其在血液中表達(dá)情況的研究仍較少。在人類的外周血中表達(dá)的防御素基因有α防御素1～3，而β防御素1或2只有在受到細(xì)菌或脂多糖刺激時才表達(dá)；在家雞的外周血白細(xì)胞中，表達(dá)的防御素基因有AvBD1、AvBD2、AvBD6和AvBD7[22-23]。由此可見，不同物種血液中表達(dá)的防御素基因種類具有較大的差異，可能與物種間的特異性有關(guān)[24]。

本研究在分析飼養(yǎng)密度對揚子鱷群體防御素表達(dá)的影響時發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)密度大的揚子鱷群體血液中整體的防御素表達(dá)水平較高，因此，推測飼養(yǎng)密度是這2個飼養(yǎng)池中揚子鱷免疫狀況產(chǎn)生差異的原因之一。在有關(guān)魚類飼養(yǎng)密度和免疫基因表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，生活在高密度飼養(yǎng)環(huán)境中的多耙牙鲆，其骨骼肌和頭腎中的白細(xì)胞介素IL-1β表達(dá)水平顯著上調(diào)，并伴隨著與識別病原體相關(guān)的模式識別受體表達(dá)水平的變化[15]。這與機體感染病原體初期時免疫基因的變化十分相似，促炎性細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)上調(diào)，然后通過相關(guān)細(xì)胞通路激活免疫效應(yīng)分子如自然殺傷細(xì)胞增強因子、抗菌肽等的表達(dá)[25]。因此可推測，生活在飼養(yǎng)密度較高環(huán)境中的揚子鱷群體對環(huán)境中潛在病原體的敏感性更高，通過一系列促炎癥反應(yīng)導(dǎo)致防御素的表達(dá)水平升高。

圖3 不同性別（A）和不同飼養(yǎng)密度（B）的揚子鱷群體β 防御素基因的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of β-defensin genes for populations of Chinese alligators under different sexes(A)and stocking densities(B)

在密河鱷、尼羅鱷、巴拉圭凱門鱷等多種鱷類的人工養(yǎng)殖中，西尼羅河病毒、痘病毒、嗜皮菌、弧菌等病原體大規(guī)模的傳染造成了大量鱷魚患病或死亡[26-29]。并且研究發(fā)現(xiàn)，在高飼養(yǎng)密度的群體中密河鱷幼鱷更容易感染西尼羅河病毒[30]?？梢姡诿芗曫B(yǎng)環(huán)境中，鱷類動物對病原體具有很高的敏感性。另外，在人類中已有關(guān)于疾病與防御素相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)在炎癥性腸病、肺結(jié)節(jié)病、丙型病毒性肝炎等疾病患者的外周血中防御素基因的表達(dá)水平顯著升高[31-33]?？梢?，防御素作為免疫和炎癥的介質(zhì)，其在外周血中的表達(dá)水平可作為某些疾病活動的生物標(biāo)志物。由于在鱷類動物中該方面的研究仍未見報道，因此，關(guān)于高飼養(yǎng)密度下?lián)P子鱷群體防御素表達(dá)升高對揚子鱷群體的健康狀態(tài)和環(huán)境適應(yīng)能力的長期影響還需進行更深入的研究。但是，今后可將防御素基因表達(dá)水平作為評價揚子鱷免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一，以更加全面地評估揚子鱷圈養(yǎng)種群的免疫狀態(tài)及人工飼養(yǎng)環(huán)境對其免疫能力的影響。

4 結(jié)論

本研究成功獲得了揚子鱷β防御素基因的血液表達(dá)譜，檢測出在揚子鱷血液中表達(dá)的2 個防御素基因AsBD5和AsBD8；并且發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)密度較高的揚子鱷群體整體的防御素表達(dá)水平顯著升高，說明飼養(yǎng)密度在一定程度上對群體的免疫狀態(tài)造成了影響，為揚子鱷今后的物種保護和種群管理工作提供了新的線索。