鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響

李?，B，秦 勇，周雅琳，劉 偉，李 雍，于蘭蘭，陳宇涵，許雅君,2,*

（1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191；2.食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

鷹嘴豆是南亞、中東、北非等地的一種主要食用豆類，因其耐干旱、耐寒冷及生物固氮等特性，廣泛種植于我國(guó)北部、西部等干旱及半干旱地區(qū)[1-2]。鷹嘴豆含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，其功效比值、消化吸收及生物利用率遠(yuǎn)高于大豆等豆類[3]，因而享有“豆中之王”的美譽(yù)。鷹嘴豆肽是提取自鷹嘴豆的植物多肽，具有溶解性好、穩(wěn)定性高和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)[4]。近年來(lái)研究表明，鷹嘴豆肽作為一種重要的生物活性肽，具有調(diào)節(jié)糖代謝[4]、抗氧化[5-13]、抗腫瘤[6,14-15]、促進(jìn)脂肪代謝和降低膽固醇[7]、降血壓[16]等功能，但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于鷹嘴豆肽對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析鷹嘴豆肽對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的體質(zhì)量、免疫臟器指數(shù)及形態(tài)、骨髓細(xì)胞核、細(xì)胞因子、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群等指標(biāo)的影響，探究其免疫調(diào)節(jié)作用。以期為開(kāi)發(fā)植物類多肽的保健應(yīng)用提供新思路，為拓寬地區(qū)特色鷹嘴豆的商業(yè)用途提供理論依據(jù)的同時(shí)促進(jìn)西部農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康SPF級(jí)雄性ICR小鼠60 只，6～8 周齡，體質(zhì)量22.0～28.0 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0010，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度為50%～60%，晝夜照明時(shí)間12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

鷹嘴豆肽是以鷹嘴豆為原料，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)提取、復(fù)合酶解以及多級(jí)膜分離提純等工藝步驟制得的小分子肽類混合物，大部分分子質(zhì)量小于1 000 Da，主要工藝流程包括調(diào)漿乳化、浸提、蛋白酶解、離心分離、滅酶、濃縮、滅菌、噴霧干燥等步驟。依據(jù)GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定鷹嘴豆肽的氨基酸組成及含量（表1）。用高效液相色譜對(duì)酶解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，鷹嘴豆肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布見(jiàn)圖1。

表1 鷹嘴豆肽氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of chickpea peptide

圖1 鷹嘴豆肽相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig. 1 Relative molecular mass distribution of chickpea peptide

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M、IgG、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素（interleukin，IL）-2、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9和IL-17A試劑盒 南京建成生物工程研究所；酪蛋白、環(huán)磷酰胺 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPN3001F電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；FLUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG Labtech公司；E400正置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；BFX5-320型低溫自動(dòng)平衡離心機(jī)、FACS Calibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；MEK-6318K全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 日本光電工業(yè)株式會(huì)社；HH·S11-1電熱恒溫水浴鍋 上海雙旭電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及受試樣品給予

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，稱量其體質(zhì)量記為初始體質(zhì)量，并按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、環(huán)磷酰胺模型組及鷹嘴豆肽低、中、高劑量組，每組各12 只。實(shí)驗(yàn)前3 d，除空白組外，其余各組每天腹腔注射80 mg/kgmb的環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型[17-19]，空白組注射等量的生理鹽水。第4天起，每天灌胃空白組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠1.6 g/kgmb酪蛋白，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組分別灌胃0.4、0.8、1.6 g/kgmb鷹嘴豆肽溶液，灌胃體積為0.1 mL/（10 gmb），連續(xù)灌胃15 d后隔夜禁食，次日晨起檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.2.1 體質(zhì)量和免疫臟器指數(shù)測(cè)定

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，小鼠稱質(zhì)量記為初始體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分組，腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d后稱質(zhì)量記為造模后體質(zhì)量，灌胃15 d后稱質(zhì)量記為終末體質(zhì)量。動(dòng)物處死前再次稱質(zhì)量，供免疫臟器指數(shù)計(jì)算時(shí)使用。各組動(dòng)物摘眼球取血后斷頸處死，用電子天平稱量分離的脾臟和胸腺組織，用臟器質(zhì)量（mg）除以小鼠處死前體質(zhì)量（g）得到小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)[20]。

1.3.2.2 脾臟和胸腺形態(tài)學(xué)觀察

將稱質(zhì)量后的脾臟和胸腺固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡下選取適當(dāng)倍數(shù)，觀察脾臟和胸腺組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.3.2.3 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)

動(dòng)物摘眼球取血后，取適量全血于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，充分混勻，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[19]。

1.3.2.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

動(dòng)物摘眼球取血，取適量全血于EDTA抗凝管中，吸取50 μL全血于流式管，加入3 種熒光染料綴合的抗體，吹打混勻。室溫下避光孵育30 min，每隔5 min搖晃混勻，然后加入1 mL裂解液，裂解完成后加入1 mL磷酸鹽緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，彈散細(xì)胞。加入1 mL磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，350×g離心5 min，棄上清液，加入200 μL的2%多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞及CD8+細(xì)胞亞群比例。

1.3.2.5 外周血免疫球蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

動(dòng)物摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min制得血清，取50 μL血清，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IgG和IgM的質(zhì)量濃度。

1.3.2.6 血清中細(xì)胞因子水平測(cè)定

另取200 μL血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9和IL-17A的質(zhì)量濃度[21]。

1.3.2.7 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和DNA質(zhì)量濃度

每組隨機(jī)選擇6 只小鼠，取其右腿股骨進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)：剔除股骨附著的結(jié)締組織和肌肉，用1 mL Hank’s液將骨髓沖至已經(jīng)加入了EDTA的離心管內(nèi)。吸取0.38 mL的鹽酸溶液（0.1 mol/L）于另一離心管，加入混勻后的骨髓液20 μL，再次混勻，靜置2～3 min待紅細(xì)胞溶解。將20 μL上述溶液注入細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

另取剩余6 只小鼠右腿股骨進(jìn)行骨髓DNA質(zhì)量濃度檢測(cè)：吸取10 mL的CaCl2溶液（5 mmol/L），將骨髓注入離心管中，4 ℃環(huán)境下放置30 min，2 500 r/min離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入5 mL 0.2 mol/L的HClO4溶液，充分混勻后在90 ℃的水浴鍋水浴15 min，冷卻至室溫，3 500 r/min離心15 min后，將20 μL上清液注入96 孔板，用多功能酶標(biāo)儀在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A260nm并計(jì)算骨髓的DNA質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為連續(xù)變量，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析比較組間差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。方差齊時(shí)，用SNK法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，用Tamhane’s法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量和免疫臟器指數(shù)的變化

表2 鷹嘴豆肽對(duì)免疫抑制小鼠體質(zhì)量和免疫臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of chickpea peptide on body mass and immune organ indexes of immunocompromised mice

如表2所示，各組小鼠初始體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），環(huán)磷酰胺造模3 d后，4 個(gè)造模組小鼠體質(zhì)量與空白組相比均極顯著降低（P＜0.01），但實(shí)驗(yàn)15 d后的終末體質(zhì)量各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各組小鼠胸腺指數(shù)之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與空白組相比，模型組、鷹嘴豆肽低劑量和高劑量組脾臟指數(shù)增大（P＜0.01）；與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組脾臟指數(shù)均有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 免疫臟器形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

鏡下脾臟HE染色切片如圖2所示，空白組脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，脾小結(jié)發(fā)育良好，紅髓、白髓清楚可辨，邊緣區(qū)界限清晰。模型組紅髓與白髓界限模糊，脾小結(jié)存在破損現(xiàn)象，脾臟腫大。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組脾小結(jié)有所恢復(fù)，結(jié)構(gòu)逐漸清晰，中、高劑量組基本恢復(fù)到空白組水平。

圖2 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)變化的影響（×100）Fig. 2 Effect of chickpea peptide on morphological changes in spleen tissues of immunocompromised mice (× 100)

圖3 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)變化的影響（×40）Fig. 3 Effect of chickpea peptide on morphological changes in thymus tissue of immunocompromised mice (× 40)

鏡下胸腺HE染色切片如圖3所示，空白組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)染色較深且面積較大，可觀察到排列緊密的淋巴細(xì)胞。模型組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)分界不清，可觀察到皮質(zhì)面積減小和髓質(zhì)面積增加，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組皮質(zhì)面積增加，皮、髓交界逐漸清晰，中、高劑量組基本恢復(fù)到空白組水平。

2.3 外周血白細(xì)胞數(shù)的變化

表3 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Table 3 Effect of chickpea peptide on white blood cell count of immunocompromised mice

如表3所示，與空白組相比，模型組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)有所下降（P＜0.05）；鷹嘴豆肽干預(yù)后，各劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸恢復(fù)，與模型組相比，高劑量組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加（P＜0.05），且基本恢復(fù)到空白組水平。

2.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

表4 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響Table 4 Effect of chickpea peptide on T lymphocyte subsets in peripheral blood of immunocompromised mice

如表4所示，各組間CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例均無(wú)顯著差異。與空白組相比，模型組各項(xiàng)指標(biāo)均有所降低，鷹嘴豆肽干預(yù)的中、高劑量組有不同程度的恢復(fù)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 外周血免疫球蛋白含量的變化

表5 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠外周血免疫球蛋白IgG、IgM質(zhì)量濃度的影響Table 5 Effect of chickpea peptide on the contents of immunoglobulin G and immunoglobulin M in peripheral blood of immunocompromised mice

如表5 所示，與空白組相比，模型組和鷹嘴豆肽各干預(yù)組外周血I g G 和I g M 質(zhì)量濃度均有所降低（P＜0.05），與模型組相比，鷹嘴豆肽低劑量組的IgG質(zhì)量濃度和中劑量組的IgM質(zhì)量濃度有一定程度的恢復(fù)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 血清中細(xì)胞因子水平的變化

如表6所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞因子質(zhì)量濃度均增加，大部分表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與模型組相比，鷹嘴豆肽中、高劑量組小鼠血清中IL-17A質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），且低于空白組水平。與模型組相比，小鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度隨鷹嘴豆肽劑量增加而逐漸降低，且在高劑量組中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），并低于對(duì)照組水平。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組小鼠血清中IL-5質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），且在中、高劑量組低于空白組水平。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組小鼠血清中IL-9質(zhì)量濃度均有所降低，且在低劑量組中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組小鼠血清中IL-4質(zhì)量濃度隨鷹嘴豆肽劑量增加而降低，且逐漸恢復(fù)至空白組水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，鷹嘴豆肽各干預(yù)組小鼠血清中IFN-γ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠外周血細(xì)胞因子水平的影響Table 6 Effect of chickpea peptide on cytokine levels in peripheral blood of immunocompromised mice

2.7 骨髓有核細(xì)胞數(shù)和DNA質(zhì)量濃度的變化

表7 鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和DNA質(zhì)量濃度的影響Table 7 Effect of chickpea peptide on the number of nucleated cells and DNA content in bone marrow of immunocompromised mice

如表7所示，與空白組相比，模型組的骨髓有核細(xì)胞濃度和DNA質(zhì)量濃度極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組骨髓有核細(xì)胞濃度均有不同程度的升高，在中、高劑量組表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且基本恢復(fù)至空白組水平。與模型組相比，鷹嘴豆肽干預(yù)后各組小鼠骨髓DNA質(zhì)量濃度有不同程度的恢復(fù)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

越來(lái)越多的研究顯示，生物活性肽具有調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動(dòng)和某些特定生理活性的功能，如抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)血壓等[22-24]。研究表明，多種豆類多肽具有增強(qiáng)免疫的作用。大豆肽能增加白細(xì)胞數(shù)量，提高血清溶血素、IgM和IgG水平，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的活性，增加CD8+、CD11b+、CD49b+和CD56+的數(shù)量，并上調(diào)免疫相關(guān)基因的表達(dá)[25-30]。豌豆肽對(duì)免疫功能具有改善作用[31-32]。綠豆肽具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞自噬，改變細(xì)胞因子水平而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性[33]。

鷹嘴豆是一種脂肪含量較低、蛋白質(zhì)功效比值較高、消化率較高的植物類食品，鷹嘴豆經(jīng)蛋白酶解后得到的鷹嘴豆肽仍是一種高蛋白、低脂肪的產(chǎn)品，其多肽含量高，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.86%，且水分和灰分含量都極低。鷹嘴豆肽必需氨基酸種類齊全且相對(duì)分子質(zhì)量小，易于消化吸收[34]。鷹嘴豆肽作為一種生物活性肽，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有多種生物活性功能，但其調(diào)節(jié)免疫功能的研究卻鮮有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)中所用鷹嘴豆肽富含的氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸等，其中谷氨酸和天冬氨酸含量最高。已有研究顯示具有免疫調(diào)節(jié)功能的食源性蛋白肽多是包含2～10 個(gè)殘基和具有一定疏水性的短肽，有谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等疏水性氨基酸的蛋白肽具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性[35-42]。因此，推測(cè)鷹嘴豆肽的免疫活性可能與其氨基酸組成有關(guān)。

眾所周知，環(huán)磷酰胺是一種常用的細(xì)胞毒性藥物，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療，可抑制骨髓功能，降低白細(xì)胞數(shù)量。其細(xì)胞毒性作用是化學(xué)反應(yīng)代謝產(chǎn)物的結(jié)果，這些代謝產(chǎn)物通過(guò)產(chǎn)生交聯(lián)來(lái)烷基化DNA和蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，環(huán)磷酰胺可抑制小鼠免疫器官功能并導(dǎo)致體質(zhì)量減輕，還能引起外周血中各種血細(xì)胞的失衡，最終導(dǎo)致免疫功能的抑制[43]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺，建立免疫低下小鼠模型，給予鷹嘴豆肽灌胃干預(yù)15 d，評(píng)價(jià)鷹嘴豆肽對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)選用相同飼養(yǎng)條件下的小鼠作為空白組，考慮到鷹嘴豆肽本身作為蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，也有一定的蛋白功能，故給予空白組和模型組小鼠和高劑量鷹嘴豆肽組相同劑量的酪蛋白以消除可能由于總蛋白攝入差異造成的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠初始體質(zhì)量與終末體質(zhì)量均無(wú)顯著差異，但造模后小鼠體質(zhì)量降低，提示環(huán)磷酰胺具有明顯的毒性，這與以往的研究結(jié)果[44]一致。

脾臟和胸腺是機(jī)體質(zhì)量要的免疫器官，胸腺是T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，脾臟富含B、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所，也是動(dòng)物最大的免疫器官，它們的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)在一定程度上反映了機(jī)體的免疫情況。本次實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠的脾臟指數(shù)較空白組顯著增加，病理檢查結(jié)果提示存在脾臟充血、水腫和增生肥大；與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組脾臟指數(shù)降低，提示脾臟充血、水腫和增生肥大有所緩解。在鷹嘴豆肽干預(yù)下，脾臟和胸腺的組織形態(tài)出現(xiàn)了明顯改善。與空白組相比，模型組小鼠的脾臟和胸腺鏡下可見(jiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，發(fā)育較差，而經(jīng)鷹嘴豆肽干預(yù)后，小鼠的脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。提示鷹嘴豆肽對(duì)兩大免疫器官有一定的保護(hù)和修復(fù)損傷的作用。

骨髓是造血過(guò)程的主要場(chǎng)所，也是機(jī)體質(zhì)量要的免疫組織，經(jīng)分化可以產(chǎn)生各種血細(xì)胞而發(fā)揮其生理功能，是人體免疫中不可缺少的部分[44]。白細(xì)胞因?yàn)榫哂型淌晒δ埽诘钟≡w的入侵方面起著關(guān)鍵作用，是機(jī)體中重要的免疫細(xì)胞。白細(xì)胞數(shù)量下降會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答減弱，增加感染風(fēng)險(xiǎn)[45]。因此，骨髓和白細(xì)胞的狀況也可以反映機(jī)體的免疫情況。本實(shí)驗(yàn)觀察到環(huán)磷酰胺造模后，小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓有核細(xì)胞濃度和骨髓DNA質(zhì)量濃度相比空白組均顯著降低，并在鷹嘴豆肽干預(yù)后出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。提示鷹嘴豆肽可以改善免疫低下小鼠的骨髓抑制狀態(tài)和免疫功能。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是主動(dòng)免疫后機(jī)體產(chǎn)生的主要抗體，在體液免疫中最為重要，在免疫監(jiān)視、抗感染、吞噬和溶解靶細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，IgM是血清中分子質(zhì)量最大的免疫球蛋白，在初次免疫中占有重要地位，在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮抗感染作用，其在血清中的含量能體現(xiàn)機(jī)體的體液免疫功能。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清IgG和IgM質(zhì)量濃度有所降低，并在部分鷹嘴豆肽干預(yù)組得到恢復(fù)。提示鷹嘴豆肽可能通過(guò)恢復(fù)IgG和IgM質(zhì)量濃度來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫。

T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞[46]。根據(jù)其表面標(biāo)志物的不同，可分為CD3+、CD4+、CD8+等細(xì)胞亞群，其中CD3+為成熟T細(xì)胞表面標(biāo)志，可代表T細(xì)胞的總體水平，CD4+細(xì)胞即輔助T細(xì)胞，在細(xì)胞免疫中起輔助作用，CD8+細(xì)胞即細(xì)胞毒性T細(xì)胞，通過(guò)降低淋巴細(xì)胞的活性，發(fā)揮抑制細(xì)胞免疫的作用。適當(dāng)?shù)腃D4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群比例和計(jì)數(shù)是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。T淋巴細(xì)胞亞群的不平衡會(huì)導(dǎo)致免疫功能紊亂，導(dǎo)致一系列的免疫病理改變，影響機(jī)體的免疫保護(hù)機(jī)制[47]。在本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，各組小鼠CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞亞群比例有所降低，但在鷹嘴豆肽干預(yù)的中劑量組有一定程度的恢復(fù)。說(shuō)明鷹嘴豆肽對(duì)免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫有一定的改善作用。

環(huán)磷酰胺會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放，這些因子在宿主對(duì)抗感染和炎癥的免疫應(yīng)答中起著重要作用。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激后合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)或肽類，通過(guò)結(jié)合相應(yīng)受體后調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，從而調(diào)控免疫應(yīng)答[46]。環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞因子的影響主要是影響Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2和TLR4信號(hào)通路，激活核因子κB，導(dǎo)致下游多種炎癥因子（如IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ[48-49]）的改變而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，相比空白組，多數(shù)模型組細(xì)胞因子濃度明顯升高，經(jīng)鷹嘴豆肽干預(yù)后，IL-17A、IL-2、IL-5和IL-9質(zhì)量濃度均顯著降低并向空白組回歸。提示鷹嘴豆肽可能通過(guò)影響IL-17A、IL-2、IL-5、IL-9等細(xì)胞因子的分泌而影響其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，改善機(jī)體的免疫功能。

本實(shí)驗(yàn)初步探究了鷹嘴豆肽對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的體質(zhì)量、免疫臟器指數(shù)、免疫組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、外周血白細(xì)胞數(shù)量、外周血T淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子、骨髓有核細(xì)胞和DNA濃度的影響，結(jié)果提示鷹嘴豆肽對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的多項(xiàng)免疫功能均有較顯著的改善作用，為鷹嘴豆肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。