優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響

劉 慧，周建新，方 勇，邱偉芬

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

稻谷是我國(guó)主要的糧食作物，占全國(guó)糧食總量的40%[1]。儲(chǔ)藏階段的稻谷可能遭受各種微生物的污染，從而影響儲(chǔ)藏安全和食用品質(zhì)，有些微生物在適宜條件下還會(huì)分泌毒素，對(duì)人類(lèi)健康和生命造成嚴(yán)重威脅[2]。霉菌由于其生長(zhǎng)對(duì)所需水分與溫度等條件的要求遠(yuǎn)比細(xì)菌、放線菌和酵母菌低，成為對(duì)稻谷危害最大的微生物，加之我國(guó)稻谷儲(chǔ)藏期長(zhǎng)及儲(chǔ)藏條件不夠完善，霉菌活動(dòng)對(duì)稻谷品質(zhì)造成嚴(yán)重影響[3-4]。目前已有不少學(xué)者對(duì)稻谷中霉菌的種類(lèi)及霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響進(jìn)行了研究[5-7]，但是不同霉菌菌株對(duì)稻谷品質(zhì)影響差異的研究尚少。因此，本研究擬通過(guò)將分離自稻谷的不同霉菌菌株接種于無(wú)菌稻谷上，分析稻谷的霉菌生長(zhǎng)情況、品質(zhì)指標(biāo)及相關(guān)酶活力變化，探究不同霉菌菌株對(duì)稻谷品質(zhì)的影響，以確定對(duì)稻谷品質(zhì)影響較大的菌株從而進(jìn)行重點(diǎn)防控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈稻（2017年收獲）采樣于湖南省衡陽(yáng)市角山米業(yè)有限責(zé)任公司。按照GB/T 5491—1985《糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法》，采用3 層、5 點(diǎn)取樣法，分別以糧倉(cāng)東南角、東北角、西南角、西北角以及中央點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)分別在距糧堆表層0.5 m、中央層、距地面0.5 m取樣，樣品放置在無(wú)菌采樣袋中，于4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前將15 個(gè)點(diǎn)的樣品等量混合。

高鹽察氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；淀粉酶測(cè)試盒、多酚氧化酶測(cè)試盒、過(guò)氧化物酶測(cè)試盒、植物丙二醛測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)試盒南京建成生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；CM-5色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；JH-722s可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；101-3AS電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠；ELX800酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 稻谷樣品中霉菌的分離純化與鑒定

稻谷樣品中霉菌的分離純化參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，選用高鹽察氏培養(yǎng)基，加入稻谷樣品稀釋液，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，將獲得的菌株通過(guò)劃線分離培養(yǎng)法、三點(diǎn)法進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，得到純化菌株。將純化菌株進(jìn)行顯微觀察，拍攝其菌落、菌絲及孢子照片，對(duì)菌株進(jìn)行初步判斷。同時(shí)對(duì)得到的純化菌株提取DNA[8],以引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST對(duì)比。將鑒定過(guò)的菌株斜面培養(yǎng)，用液體石蠟隔絕空氣[9]后，于4 ℃保存。

1.3.2 稻谷輻照滅菌

參照沈飛等[10]的方法，將稻谷樣品經(jīng)南京航空航天大學(xué)輻照中心60Co輻照（12 kGy）滅菌后裝入無(wú)菌塑料密封袋，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 霉菌孢子懸浮液制備

參照張繼忠等[11]的方法，將蠟封保藏的菌株接種至新的斜面培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待霉菌生長(zhǎng)產(chǎn)生大量孢子，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面，收集孢子懸浮液，置于三角瓶中振蕩10 min，再用無(wú)菌脫脂過(guò)濾除去營(yíng)養(yǎng)菌體。將得到的孢子懸浮液，按照GB/T 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》統(tǒng)計(jì)不同霉菌孢子懸浮液濃度，并用無(wú)菌水調(diào)節(jié)懸浮液濃度至約1×108CFU/mL[12]，4 ℃冷藏備用。

1.3.4 稻谷樣品霉菌接種

無(wú)菌環(huán)境下，稱(chēng)取每份約10 g的滅菌稻谷樣品，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用移液槍精確移取0.1 mL霉菌孢子懸浮液均勻接種于樣品上，充分漩渦使其均勻分布。接種完畢后，參照楊基漢[13]、付消費(fèi)[14]等的方法，并結(jié)合采樣糧庫(kù)的實(shí)際儲(chǔ)藏環(huán)境，將處理過(guò)的樣品置于30 ℃、相對(duì)濕度85%環(huán)境中進(jìn)行儲(chǔ)藏。分別在第2、4、6、8、10天取樣檢測(cè)。

1.3.5 霉菌菌落直徑的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]燕麥培養(yǎng)基的制備方法，將稻谷磨粉后過(guò)篩，取稻谷粉60 g，溶于600 mL蒸餾水中，制成勻漿，加熱至45～50 ℃。再取瓊脂12.5 g，溶于400 mL水中，與稻谷粉勻漿混合后，121 ℃滅菌90 min。滅菌結(jié)束將稻谷培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，待其凝固后，用移液槍準(zhǔn)確移取10 μL霉菌懸浮液于平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，48 h后開(kāi)始測(cè)量菌落直徑，測(cè)量間隔為12 h。測(cè)定兩條垂直的菌落直徑，以這兩垂直直徑的平均值作為菌落直徑[15]。

1.3.6 稻谷霉菌計(jì)數(shù)

參照GB 4789.15—2016，選用高鹽察氏培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d后對(duì)稻谷霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.7 色度的測(cè)定

使用CM-5色差儀對(duì)霉菌菌落進(jìn)行色度測(cè)定，為減小誤差帶來(lái)的影響，每組樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 稻谷脂肪酸值測(cè)定

稻谷脂肪酸值測(cè)定參照GB/T 15684—2015《谷物碾磨制品 脂肪酸值的測(cè)定》。

1.3.9 稻谷丙二醛含量和淀粉酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶活力測(cè)定

利用相應(yīng)試劑盒測(cè)定稻谷樣品的丙二醛含量和淀粉酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物活力，其中酶活力結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 組平行，采用JMP 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和t檢驗(yàn)，采用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷樣品中霉菌的形態(tài)學(xué)與基因鑒定結(jié)果

形態(tài)學(xué)主要觀察菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等，使用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察菌絲與孢子的形態(tài)[16]。將分離純化的霉菌菌屬進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果如表1所示[17-18]。經(jīng)過(guò)霉菌形態(tài)學(xué)對(duì)比和測(cè)序，確定稻谷樣品中的主要霉菌屬有黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillus terreus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）和島青霉（Penicilliumsp. MF555）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他研究人員對(duì)稻谷霉菌區(qū)系調(diào)查結(jié)果[19-22]一致，即稻谷在儲(chǔ)藏過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)霉菌為黃曲霉、黑曲霉等曲霉屬和產(chǎn)黃青霉、桔青霉等青霉屬。

2.2 稻谷霉菌菌落直徑與接種稻谷霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果

表1 稻谷中主要可培養(yǎng)霉菌菌屬鑒定結(jié)果Table 1 Identification of main cultivable fungi isolated from rice

圖1 不同霉菌菌株在稻谷培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig. 1 Growth of different mold strains in rice medium

稻谷樣品中不同霉菌在稻谷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)趨勢(shì)和菌落直徑變化分別如圖1A、B所示。由圖1可以看出，不同霉菌菌株在稻谷培養(yǎng)基中快速增長(zhǎng)，表明稻谷是曲霉屬和青霉屬良好的生長(zhǎng)基質(zhì)。不同霉菌菌落的增長(zhǎng)速率與菌落直徑之間存在差異，以黑曲霉菌落直徑增長(zhǎng)最快，菌落直徑最大，其次是黃曲霉、米曲霉、土曲霉，青霉屬菌落直徑增長(zhǎng)速率相對(duì)于曲霉屬較為緩慢，以島青霉最為遲緩，表明曲霉屬在稻谷中的污染范圍較青霉屬更快更大。

圖2 接種不同菌株的稻谷霉菌數(shù)量變化Fig. 2 Changes in number of different inoculated mold strains on rice

稻谷霉菌量與是否發(fā)生霉變及霉變的程度有關(guān)，霉菌量在3.0（lg（CFU/g））以下時(shí)，稻谷處于未霉變狀態(tài),在3.0～7.0（lg（CFU/g））時(shí)處于霉變狀態(tài)，超過(guò)7.0（lg（CFU/g））時(shí)霉變已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重[23]。實(shí)驗(yàn)選取霉變狀態(tài)稻谷以探究不同霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)與相關(guān)酶活力的影響。如圖2所示，對(duì)接種不同霉菌孢子懸浮液2 d后的稻谷樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)霉菌菌落總數(shù)均在6.012～6.350（lg（CFU/g））之間，說(shuō)明接種成功。不同菌株接種于稻谷樣品后，霉菌便開(kāi)始快速增殖，樣品霉變程度逐漸加深。不同霉菌菌株的增長(zhǎng)速率之間存在差異，以黃曲霉和黑曲霉繁殖速率最快，儲(chǔ)藏10 d后菌落總數(shù)分別增加了2.029、1.960（lg（CFU/g）），其次是米曲霉和島青霉，繁殖速率較慢的是桔青霉和產(chǎn)黃青霉，儲(chǔ)藏10 d后菌落總數(shù)分別增加了0.620（lg（CFU/g））和0.770（lg（CFU/g））。

2.3 接種稻谷樣品主要品質(zhì)變化

2.3.1 色度的變化

圖3 接種不同菌株的稻谷外觀和色度變化Fig. 3 Changes in appearance and color parameters of rice inoculated with different strains

L*值代表明度，ΔL*為正表示偏白，為負(fù)表示偏暗；b*值代表褐變程度，Δb*為正表示黃色，為負(fù)表示藍(lán)色[24.25]。由圖3可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，稻谷顏色逐漸加深，至儲(chǔ)藏第4天，霉菌菌落開(kāi)始覆蓋稻谷表面，儲(chǔ)藏至第10天時(shí)，黃曲霉、黑曲霉、米曲霉幾乎將稻谷表面全部覆蓋，土曲霉和青霉屬菌株菌落覆蓋稻谷表面面積較小，這與不同菌株菌落直徑的測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，稻谷L*值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)榍箤俸颓嗝箤倬暝谏L(zhǎng)初期會(huì)先長(zhǎng)出白色菌絲，導(dǎo)致稻谷表面明度上升[26]。儲(chǔ)藏末期，接種黑曲霉的稻谷表面L*值下降至66.33，在接種稻谷中亮度最低，其次是黃曲霉和米曲霉，分別為71.64和72.28，土曲霉和青霉屬菌株由于自身顏色和菌落生長(zhǎng)較慢，對(duì)稻谷表面明度影響較小。除接種黑曲霉的稻谷外，接種其他霉菌的稻谷b*值呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，說(shuō)明稻谷表面顏色逐漸向黃褐色轉(zhuǎn)變，至儲(chǔ)藏末期，接種黃曲霉的稻谷表面褐變最嚴(yán)重，b*值達(dá)到了21.39，其次是米曲霉，達(dá)到了17.01，接種土曲霉和青霉屬菌株的稻谷表面褐變程度相近，b*值在16.23左右。

2.3.2 脂肪酸值的變化

圖4 接種不同菌株的稻谷脂肪酸值變化Fig. 4 Changes in fatty acid value of rice inoculated with different strains

稻谷中的脂類(lèi)通過(guò)氧化降解為游離脂肪酸，一般來(lái)說(shuō)脂肪酸值越高，稻谷品質(zhì)越差[27]。由圖4可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，接種菌株后的稻谷脂肪酸值呈先上升后下降的趨勢(shì)。在儲(chǔ)藏第6天，脂肪酸值達(dá)到最高，其中接種黑曲霉的稻谷脂肪酸值最高，達(dá)到了346.78 mg/100 g，其次是接種黃曲霉的稻谷（252.7 mg/100 g），接種土曲霉、米曲霉和青霉的稻谷脂肪酸值為100 mg/100 g。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是前期脂類(lèi)物質(zhì)大量水解成游離脂肪酸，后期脂肪酸氧化成酮、醛等物質(zhì)的速度加快，導(dǎo)致脂肪酸值降低[28]。在整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中，接種黑曲霉的稻谷脂肪酸值上升最快，其次是黃曲霉，接種桔青霉的稻谷脂肪酸值略高于米曲霉，脂肪酸值變化最小的是接種土曲霉的稻谷。在儲(chǔ)藏末期，脂肪酸值最高的是接種黑曲霉的稻谷，為148.93 mg/100 g，其次是接種黃曲霉的稻谷，為118.48 mg/100 g，接種米曲霉、桔青霉、土曲霉、產(chǎn)黃青霉和島青霉的稻谷脂肪酸值均下降至100 mg/100 g以下。

2.3.3 丙二醛含量的變化

如圖5所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，稻谷丙二醛含量持續(xù)增加，儲(chǔ)藏前期稻谷丙二醛含量增加較慢，儲(chǔ)藏8 d后，丙二醛含量快速增加，增加趨勢(shì)呈現(xiàn)“前慢后快”的特點(diǎn)，一方面可能是因?yàn)閮?chǔ)藏后期細(xì)胞氧化損傷不斷積累，膜脂過(guò)氧化程度嚴(yán)重，細(xì)胞逐漸裂解[29]；另一方面，經(jīng)過(guò)儲(chǔ)藏前期的積累，稻谷中存在大量脂肪酸，氧化后導(dǎo)致丙二醛含量快速增加[30]。儲(chǔ)藏末期，接種黑曲霉的稻谷丙二醛含量最高，為108.82 nmol/g，其次是接種黃曲霉的稻谷，丙二醛含量為96.47 nmol/g，接下來(lái)依次是接種島青霉、桔青霉、產(chǎn)黃青霉、米曲霉和土曲霉的稻谷。

圖5 接種不同菌株的稻谷丙二醛含量變化Fig. 5 Changes of malondialdehyde content in rice inoculated with different strains

2.4 接種稻谷樣品酶活力變化

圖6 接種不同菌株的稻谷淀粉酶活力變化Fig. 6 Changes in amylase activity in rice inoculated with different strains

2.4.1 淀粉酶活力的變化

淀粉酶活力影響稻谷的食用品質(zhì)，其降低會(huì)導(dǎo)致淀粉黏度下降[31]。由圖6可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉酶活力不斷下降，這可能是因?yàn)樯矬w受到生物或非生物脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除動(dòng)態(tài)平衡被破壞，過(guò)多的自由基會(huì)攻擊細(xì)胞蛋白、DNA和膜結(jié)構(gòu)，使得淀粉酶活力降低[32]。至儲(chǔ)藏末期，接種島青霉的稻谷淀粉酶活力最低，為0.000 7 U/mg，其次是接種土曲霉的稻谷（0.004 9 U/mg），接下來(lái)依次是接種產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、桔青霉、米曲霉、黃曲霉的稻谷。

圖7 接種不同菌株的稻谷多酚氧化酶活力變化Fig. 7 Changes in polyphenol oxidase activity in rice inoculated with different strains

2.4.2 多酚氧化酶活力的變化

多酚氧化酶會(huì)引起稻谷發(fā)生酶促褐變，催化內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化成黑色素，導(dǎo)致稻谷表面顏色不斷加深[33-34]。由圖7可知，隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組稻谷多酚氧化酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與自由基積累有關(guān)。儲(chǔ)藏末期，接種黃曲霉的稻谷多酚氧化酶活力最低（2.444 U/mg），其次是接種米曲霉的稻谷（4.000 U/mg），接下來(lái)依次是接種黑曲霉、土曲霉、島青霉、產(chǎn)黃青霉和桔青霉的稻谷。

2.4.3 過(guò)氧化氫酶活力的變化

圖8 接種不同菌株的稻谷過(guò)氧化氫酶活力變化Fig. 8 Changes in catalase activity in rice inoculated with different strains

過(guò)氧化氫酶是生命體內(nèi)酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)的主要物質(zhì)，可以催化H2O2生成水和氧氣[35-36]。由圖8可知，稻谷接種霉菌菌株后，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基不能被及時(shí)清除，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白、DNA和膜結(jié)構(gòu)被攻擊，使得過(guò)氧化氫酶活力不斷下降。在儲(chǔ)藏末期，接種黃曲霉的稻谷過(guò)氧化氫酶活力最低（0.014 U/mg），其次是接種黑曲霉的稻谷（0.181 U/mg），接下來(lái)依次是接種產(chǎn)黃青霉、桔青霉、島青霉、米曲霉和土曲霉的稻谷。

3 結(jié) 論

經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)和基因鑒定，發(fā)現(xiàn)湖南稻谷中主要的可培養(yǎng)霉菌菌種為黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillus terreus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）和島青霉（Penicilliumsp. MF555）。在這7 種菌株中，黃曲霉與黑曲霉對(duì)稻谷產(chǎn)生相對(duì)更大的劣變影響，其中接種這兩種菌的稻谷儲(chǔ)藏10 d后菌落總數(shù)分別增加了2.029、1.960（lg（CFU/g）），且?guī)缀鯇⒌竟缺砻嫒扛采w，而儲(chǔ)藏末期，接種黃曲霉的稻谷褐變最為嚴(yán)重。在儲(chǔ)藏末期，脂肪酸值最高的是接種黑曲霉的稻谷（148.93 mg/100 g），其次是接種黃曲霉的稻谷（118.48 mg/100 g），接種黑曲霉的稻谷丙二醛含量最高（108.82 nmol/g），其次是接種黃曲霉的稻谷（96.47 nmol/g）。至儲(chǔ)藏末期，島青霉對(duì)稻谷淀粉酶活力影響最大，第10天時(shí)只有0.000 7 U/mg。而對(duì)多酚氧化酶影響最大的是黃曲霉，儲(chǔ)藏到第10天僅為2.444 U/mg。在儲(chǔ)藏末期，對(duì)稻谷過(guò)氧化氫酶影響最大的也是黃曲霉和黑曲霉，儲(chǔ)藏10 d時(shí)酶活力分別為0.014 U/mg和0.181 U/mg。根據(jù)前研究結(jié)果表明，黃曲霉和黑曲霉是稻谷儲(chǔ)藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌株，且本實(shí)驗(yàn)證明了這兩種菌株對(duì)稻谷品質(zhì)影響較大，因此在未來(lái)有關(guān)儲(chǔ)糧安全的研究中，應(yīng)該更加關(guān)注對(duì)于曲霉屬，特別是對(duì)黃曲霉和黑曲霉的防控。本實(shí)驗(yàn)僅研究了單個(gè)菌株在嚴(yán)重霉變情況下對(duì)稻谷品質(zhì)的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)以此為基礎(chǔ)，繼續(xù)探究不同污染程度的多種優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響及防控優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)于稻谷儲(chǔ)藏安全的意義，以便更加明確優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)稻谷的影響。